s****9
发帖数: 932 | 1 请教版上RNA in situ hybridization的大牛，
我做In situ hybridization，设计了3对probe（500bp左右），3对proble都是发现
sense和anti－sense有相似的pattern。
我一开始觉得是non－specific binding。后来越做，我越觉得signal是对的。我做了
transfected和non transfected cell pallet，只有transfected有信号，而且sense和
anti－sense都有信号（sense弱一些）。
因为我的基因有的tissue表达，有的tissue不表达。我又多做了很多tissue，发现我的
probe有表达的tissue才亮，说明probe是好的，看起来信号也挺好。
可是怎么解释sense和anti－sense都有信号的问题？有ISH的大牛能帮忙trouble
shooting吗？ |
z****u
发帖数: 1007 | 2 你你的probe是conjugate的什么的，ALPase? biotin? HRP? fluorescence? 如果是
ALPase, 也许有内源性的ALPase. 这种情况你一样可以看到信号。但background会很
高。
ISH这技术相当tricky.事先的optimization极其重要，不然啥结果都有可能出来。我现
在是能不做ISH就不做。tissue的ISH对我们来说是标准. 看起来你做得是cell.
【在 s****9 的大作中提到】
: 请教版上RNA in situ hybridization的大牛，
: 我做In situ hybridization，设计了3对probe（500bp左右），3对proble都是发现
: sense和anti－sense有相似的pattern。
: 我一开始觉得是non－specific binding。后来越做，我越觉得signal是对的。我做了
: transfected和non transfected cell pallet，只有transfected有信号，而且sense和
: anti－sense都有信号（sense弱一些）。
: 因为我的基因有的tissue表达，有的tissue不表达。我又多做了很多tissue，发现我的
: probe有表达的tissue才亮，说明probe是好的，看起来信号也挺好。
: 可是怎么解释sense和anti－sense都有信号的问题？有ISH的大牛能帮忙trouble
: shooting吗？
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r*********n
发帖数: 8 | 3 不是ISH大牛。我猜一下原因：有没有可能在转染的细胞上面，anti-sense杂上的是
mRNA和质粒模板，而sense杂上的只是质粒模板？所以sense信号略弱
在组织切片上两个都有信号是否可能是probe太长了导致非特异结合？或者probe加的有
点多，洗的不干净？
至于不同组织的差异，我暂时想不到合理的解释。是否可以做个RT-PCR啥的实验确定组
织表达的pattern? |
g*****n
发帖数: 250 | 4 There is nothing unusual if both anti-sense and sense probes light up. Some
genes do get transcribed from both strands. The sense and anti-sense
transcripts can be in the same tissue, but may or may be in the same cell. |
s****9
发帖数: 932 | 5 你能够举个例子吗？
什么基因可以同时2个方向被transcribe
谢谢
Some
【在 g*****n 的大作中提到】
: There is nothing unusual if both anti-sense and sense probes light up. Some
: genes do get transcribed from both strands. The sense and anti-sense
: transcripts can be in the same tissue, but may or may be in the same cell.
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l********e
发帖数: 415 | 6 经典的比如Dlx5/6
另外据说20%的transcript都存在反向的:
http://nar.oxfordjournals.org/content/32/16/4812.full
我做过的ISH没有上千也有几百,
ISH sense probe 如果干净没信号,可以支持antisense好.
如果sense给出信号, 什么也不说明.
最好的control是Knock out tissue, 或者像你说的没有转染的细胞.
【在 s****9 的大作中提到】
: 你能够举个例子吗？
: 什么基因可以同时2个方向被transcribe
: 谢谢
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: Some
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g*****n
发帖数: 250 | |
