r******k 发帖数: 446 | 1 这两天在extract early endosome。 然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
里面的变化。 我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
。 然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。 但是最后一步
early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
PAGE for western blot analyses.
我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后 我的蛋白在哪里? 而且难道抽提以后还需要
vaccum dryer把蛋白都弄成干粉 然后加loading buffer煮了以后再上样? |
a*****n 发帖数: 2835 | 2 蛋白沉淀最后应该在管底,用loading buffer溶解煮了上样
endosome
endosome
SDS-
【在 r******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这两天在extract early endosome。 然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome : 里面的变化。 我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome : 。 然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。 但是最后一步 : early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS- : PAGE for western blot analyses. : 我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后 我的蛋白在哪里? 而且难道抽提以后还需要 : vaccum dryer把蛋白都弄成干粉 然后加loading buffer煮了以后再上样?
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r******k 发帖数: 446 | 3 您的意思是说 抽提完了以后离心吗????
【在 a*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 蛋白沉淀最后应该在管底,用loading buffer溶解煮了上样 : : endosome : endosome : SDS-
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e****s 发帖数: 1125 | 4 一般的Protocol
Final Methanol 90% precipitate protein,
Spin >10000rpm fro 10 min,
Wash one time with 90% methanol,
Spin agan,
carefully decay super,
Air dry 15-30 mins,
re-suspend by SDS-buffer
我有时候把Wash那步给省略了。
【在 r******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 您的意思是说 抽提完了以后离心吗????
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r******k 发帖数: 446 | 5 那氯仿呢???
谢谢
【在 e****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一般的Protocol : Final Methanol 90% precipitate protein, : Spin >10000rpm fro 10 min, : Wash one time with 90% methanol, : Spin agan, : carefully decay super, : Air dry 15-30 mins, : re-suspend by SDS-buffer : 我有时候把Wash那步给省略了。
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r******k 发帖数: 446 | 6 那氯仿呢???
谢谢
【在 e****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一般的Protocol : Final Methanol 90% precipitate protein, : Spin >10000rpm fro 10 min, : Wash one time with 90% methanol, : Spin agan, : carefully decay super, : Air dry 15-30 mins, : re-suspend by SDS-buffer : 我有时候把Wash那步给省略了。
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a*****n 发帖数: 2835 | 7 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧,看样子你要么是没
有protocol要么就是还没有做过一遍,
氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊
【在 r******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那氯仿呢??? : 谢谢
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r******k 发帖数: 446 | 8 我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提 别的没提 我也找了好久 主要不知道这
比例是多少,,,
【在 a*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧,看样子你要么是没 : 有protocol要么就是还没有做过一遍, : 氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊
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e****s 发帖数: 1125 | 9 我那个是一般甲醇沉蛋白的方法。
没用过氯仿。对蛋白来说,光甲醇就够了。氯仿可能是为了能有效的把蛋白从Endosome
的膜里抽出来。浓度你就自己搜吧。俺不知道。
通常甲醇用得多,是因为疏水性偏弱,只会沉蛋白,而不会衬核酸,所以处理细胞样品
很好。乙醇氯仿之类的就全下来了。
【在 r******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提 别的没提 我也找了好久 主要不知道这 : 比例是多少,,,
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