r******k
发帖数: 446 | 1 这两天在extract early endosome。 然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
里面的变化。 我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
。 然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。 但是最后一步
early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
PAGE for western blot analyses.
我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后 我的蛋白在哪里？ 而且难道抽提以后还需要
vaccum dryer把蛋白都弄成干粉 然后加loading buffer煮了以后再上样？ |
a*****n
发帖数: 2835 | 2 蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样
endosome
endosome
SDS-
【在 r******k 的大作中提到】
: 这两天在extract early endosome。 然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
: 里面的变化。 我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
: 。 然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。 但是最后一步
: early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
: PAGE for western blot analyses.
: 我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后 我的蛋白在哪里？ 而且难道抽提以后还需要
: vaccum dryer把蛋白都弄成干粉 然后加loading buffer煮了以后再上样？
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r******k
发帖数: 446 | 3 您的意思是说 抽提完了以后离心吗？？？？
【在 a*****n 的大作中提到】
: 蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样
:
: endosome
: endosome
: SDS-
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e****s
发帖数: 1125 | 4 一般的Protocol
Final Methanol 90% precipitate protein,
Spin >10000rpm fro 10 min,
Wash one time with 90% methanol,
Spin agan,
carefully decay super,
Air dry 15-30 mins,
re-suspend by SDS-buffer
我有时候把Wash那步给省略了。
【在 r******k 的大作中提到】
: 您的意思是说 抽提完了以后离心吗？？？？
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r******k
发帖数: 446 | 5 那氯仿呢？？？
谢谢
【在 e****s 的大作中提到】
: 一般的Protocol
: Final Methanol 90% precipitate protein,
: Spin >10000rpm fro 10 min,
: Wash one time with 90% methanol,
: Spin agan,
: carefully decay super,
: Air dry 15-30 mins,
: re-suspend by SDS-buffer
: 我有时候把Wash那步给省略了。
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r******k
发帖数: 446 | 6 那氯仿呢？？？
谢谢
【在 e****s 的大作中提到】
: 一般的Protocol
: Final Methanol 90% precipitate protein,
: Spin >10000rpm fro 10 min,
: Wash one time with 90% methanol,
: Spin agan,
: carefully decay super,
: Air dry 15-30 mins,
: re-suspend by SDS-buffer
: 我有时候把Wash那步给省略了。
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a*****n
发帖数: 2835 | 7 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧，看样子你要么是没
有protocol要么就是还没有做过一遍，
氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊
【在 r******k 的大作中提到】
: 那氯仿呢？？？
: 谢谢
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r******k
发帖数: 446 | 8 我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提 别的没提 我也找了好久 主要不知道这
比例是多少，，，
【在 a*****n 的大作中提到】
: 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧，看样子你要么是没
: 有protocol要么就是还没有做过一遍，
: 氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊
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e****s
发帖数: 1125 | 9 我那个是一般甲醇沉蛋白的方法。
没用过氯仿。对蛋白来说，光甲醇就够了。氯仿可能是为了能有效的把蛋白从Endosome
的膜里抽出来。浓度你就自己搜吧。俺不知道。
通常甲醇用得多，是因为疏水性偏弱，只会沉蛋白，而不会衬核酸，所以处理细胞样品
很好。乙醇氯仿之类的就全下来了。
【在 r******k 的大作中提到】
: 我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提 别的没提 我也找了好久 主要不知道这
: 比例是多少，，，
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