C****n
发帖数: 79 | 1 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接用Pol II, 另一个
version是加了Ribozyme structure。此外还直接用过in vitro transcribed 的gRNA.
3)用NEB 的commercial Cas9 验证过gRNA的activity。
4)本物种的转化效率不高，转化方法用的是protoplasts-PEG。
试了3回转化，利用PCR-Restrict enzyme cleavage的方法screen，但是没有得到
Mutant。
理论上来说，CRISPR 是很 straightforward的，就两个components, 请问各位大虾，
如果拿不到mutantd话，可能的原因是什么？Target？Or screening strategy? 十分
感谢！ |
m********2
发帖数: 317 | 2 我现在也遇到同样类似的问题，在one vectorv系统，即是sgRNA和cas9在同一个在题里
面表达，我得到的病毒的titer很低，试了各种方法，包括浓缩病毒，titer还是很低。 |
s******r
发帖数: 1245 | 3 只能分开做两个病毒，one vector系统就是titer低目前无解
【在 m********2 的大作中提到】
: 我现在也遇到同样类似的问题，在one vectorv系统，即是sgRNA和cas9在同一个在题里
: 面表达，我得到的病毒的titer很低，试了各种方法，包括浓缩病毒，titer还是很低。
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m*********D
发帖数: 1727 | 4 没作过真菌，所以，主意不一定合适。
你三次转化，效率不高，到你挑克隆，这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗？或带
resistance的基因？
从biotechniques的文章（Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
。。。。）来看，一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多（80%），也
就是没有indels发生。所以，他们用的是两个guide sequences（我也是这么干的），
直接切掉一段DNA。
另外，你要knockout的基因重要吗？会不会knockout后就不长了？ |
j******i
发帖数: 939 | 5 记得bacteria里边NHEJ效率低而HR效率却非常高
replacement
【在 m*********D 的大作中提到】
: 没作过真菌，所以，主意不一定合适。
: 你三次转化，效率不高，到你挑克隆，这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗？或带
: resistance的基因？
: 从biotechniques的文章（Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
: 。。。。）来看，一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多（80%），也
: 就是没有indels发生。所以，他们用的是两个guide sequences（我也是这么干的），
: 直接切掉一段DNA。
: 另外，你要knockout的基因重要吗？会不会knockout后就不长了？
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C****n
发帖数: 79 | 6 谢谢，是的，至少是TALEN也试过了，不work either.
打算mutate的基因不是一个essential的基因。
目前的strategy是based on transient expression.我的载体是带resistance maker的
，如果你熟悉Arabidopsis mesophyll protoplasts transfection 的话，目前就做完
转化后,add antibiotics to enrich positive transformants 然后就直接PCR-RE
cleavage.
另外您提供的这篇paper 很有意思. 谢谢。
replacement
【在 m*********D 的大作中提到】
: 没作过真菌，所以，主意不一定合适。
: 你三次转化，效率不高，到你挑克隆，这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗？或带
: resistance的基因？
: 从biotechniques的文章（Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
: 。。。。）来看，一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多（80%），也
: 就是没有indels发生。所以，他们用的是两个guide sequences（我也是这么干的），
: 直接切掉一段DNA。
: 另外，你要knockout的基因重要吗？会不会knockout后就不长了？
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m********2
发帖数: 317 | 7 lentiCRISPRv2 据说滴度很高，不知道如何?
【在 s******r 的大作中提到】
: 只能分开做两个病毒，one vector系统就是titer低目前无解
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m***a
发帖数: 7 | 8
is
【在 C****n 的大作中提到】
: 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
: 没有什么好的建议。
: background:
: 想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
: 在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
: not accessible.
: current status:
: 1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
: 2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
: NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
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m*********D
发帖数: 1727 | 9 我的问题不一样：为啥要用virus delivery system呢？转化（transfection)效率低的
话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题，transfection后不能等太长。而cas9是permanent deletion，又不
能保证transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal transduction cascade。老板说主意不错，得有钱
啊。：）。不知道这两个library是不是可以买或者借来用。不过，这不用自己建吧。
恕我愚钝。谢指教！
（本来跟另一个帖子的，等我打完字，好像删了。就搁这里吧。）
【在 m********2 的大作中提到】
: lentiCRISPRv2 据说滴度很高，不知道如何?
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j******i
发帖数: 939 | 10 确实很高，虽然比一般的lenti有梯度降低，但非常好用。
【在 m********2 的大作中提到】
: lentiCRISPRv2 据说滴度很高，不知道如何?
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m********2
发帖数: 317 | 11 我将puro换成了GFP，结果不好用了。病毒包装的时候GFP能达到90%，但是病毒不能感
染任何细胞.
【在 j******i 的大作中提到】
: 确实很高，虽然比一般的lenti有梯度降低，但非常好用。
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a*****i
发帖数: 2108 | 12 你说的不work是得不到transformants还是可以得到但是都是假阳性？
is
【在 C****n 的大作中提到】
: 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
: 没有什么好的建议。
: background:
: 想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
: 在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
: not accessible.
: current status:
: 1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
: 2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
: NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
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j******i
发帖数: 939 | 13 有这种事？ca9-gfp已经有发过了啊。。。应该可行的 还有一种可能是 有的病毒是三
代有的是二代 包装质粒不一样
【在 m********2 的大作中提到】
: 我将puro换成了GFP，结果不好用了。病毒包装的时候GFP能达到90%，但是病毒不能感
: 染任何细胞.
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C****n
发帖数: 79 | 14 基于resistance marker 得到转化子，也就是说CRISPR 两个 components 在里面，但
是target没有突变。
【在 a*****i 的大作中提到】
: 你说的不work是得不到transformants还是可以得到但是都是假阳性？
:
: is
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a*****i
发帖数: 2108 | 15 我是做fungi的，但是是酿酒酵母，HR活性很强所以非常好用。我听朋友说他们一直想
在pichia里用cas9，但是一直不work，应该就是HR不够造成的。问个问题，你这个菌的
NHEJ activity怎么样？
【在 C****n 的大作中提到】
: 基于resistance marker 得到转化子，也就是说CRISPR 两个 components 在里面，但
: 是target没有突变。
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a*****i
发帖数: 2108 | 16 此外补充一点个人经验之谈：gRNA的expression level是整个系统效率高低的关键。在
单倍体的情况下还不是很明显，但是多倍体里非常明显。
【在 C****n 的大作中提到】
: 基于resistance marker 得到转化子，也就是说CRISPR 两个 components 在里面，但
: 是target没有突变。
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m********2
发帖数: 317 | 17 谢谢答复
是在lentiCRISPR V2的基础上将puro更换为GFP吗?
能告诉我是那篇文章吗?
谢谢
【在 j******i 的大作中提到】
: 有这种事？ca9-gfp已经有发过了啊。。。应该可行的 还有一种可能是 有的病毒是三
: 代有的是二代 包装质粒不一样
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j******i
发帖数: 939 | 18 v2上直接改的好像没有。类似的，Zhang Feng有一篇发cell上的lentiCRISPR-EGFP, 只
不过gRNA不在同一个载体里边。14年, NBT上有一篇做老鼠模型的，cas9-gfp-gRNA全在
一个lenti载体上。
【在 m********2 的大作中提到】
: 谢谢答复
: 是在lentiCRISPR V2的基础上将puro更换为GFP吗?
: 能告诉我是那篇文章吗?
: 谢谢
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C****n
发帖数: 79 | 19 这方面没有系统的研究，但是circular载体转化以后，大部分是整合在genome 的
transposon 里，所以应该是NHEJ率很高，对吧？
【在 a*****i 的大作中提到】
: 我是做fungi的，但是是酿酒酵母，HR活性很强所以非常好用。我听朋友说他们一直想
: 在pichia里用cas9，但是一直不work，应该就是HR不够造成的。问个问题，你这个菌的
: NHEJ activity怎么样？
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C****n
发帖数: 79 | 20 谢谢，我们这个是Diploid.
你说的问题这个也是我所纠结的地方，因为没法采用一个 well-established的系统，
比如U6 promoter。
【在 a*****i 的大作中提到】
: 此外补充一点个人经验之谈：gRNA的expression level是整个系统效率高低的关键。在
: 单倍体的情况下还不是很明显，但是多倍体里非常明显。
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j****n
发帖数: 3370 | 21 难道是Yarrowia？
nhej效率非常高 我同学试着加nhej抑制剂 看看能不能提高效率
你也可以试试
[在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到：]
：这方面没有系统的研究，但是circular载体转化以后，大部分是整合在genome 的
：transposon 里，所以应该是NHEJ率很高，对吧？
：........... |
h**********r
发帖数: 671 | |
a*****i
发帖数: 2108 | 23 Diploid应该还好了。不过我们用的不是U6 promoter，是SNR52的。也许你可以做个
rtpcr看下gRNA的表达？
【在 C****n 的大作中提到】
: 谢谢，我们这个是Diploid.
: 你说的问题这个也是我所纠结的地方，因为没法采用一个 well-established的系统，
: 比如U6 promoter。
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C****n
发帖数: 79 | 24 谢谢这个信息。
其实我倒是希望想按照通常大家做的，先拿到NHEJ 的mutant，然后倒入donor DNA，然
后再HR。因为直接Gene-knock-out已经try了decades了。
【在 j****n 的大作中提到】
: 难道是Yarrowia？
: nhej效率非常高 我同学试着加nhej抑制剂 看看能不能提高效率
: 你也可以试试
: [在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到：]
: ：这方面没有系统的研究，但是circular载体转化以后，大部分是整合在genome 的
: ：transposon 里，所以应该是NHEJ率很高，对吧？
: ：...........
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C****n
发帖数: 79 | 25 情况是这样的。当然在我们这个物种里，我找到了U6(100多个copy，这个就很诡异)，
然后Northern blot也是有signal的，但是克隆后的promoter不work。所以我现在是基
本上give up pol III了。
【在 a*****i 的大作中提到】
: Diploid应该还好了。不过我们用的不是U6 promoter，是SNR52的。也许你可以做个
: rtpcr看下gRNA的表达？
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