c*********e
发帖数: 16335 | 1 中美基因专利官司涉数亿美元 中国留学生倒戈(图)
文章来源: 澎湃新闻 于 2016-08-19 22:33:19 - 新闻取自各大新闻媒体，新闻内容并
不代表本网立场！
一封18个月前的邮件，搅动了一场涉及数亿美元的官司，给一场科学家之间的专利之争
添加波澜。
打官司的两方是加州大学伯克利分校生物学家詹妮弗·杜德娜博士（Jennifer Doudna
）和麻省理工学院博德研究所（Broad Institute）实验室主任张锋，他们争夺的对象
是当前最为主流的基因编辑技术——被誉为“基因魔剪”的CRISPR-Cas9的专利。
基因编辑技术可以实现对DNA片段的敲除、加入等，在可预计的未来，将在治疗疑难杂
症上大有市场。目前已有数个关于CRISPR的生物技术公司成立，涉及数亿元的风险投资
。其中就包括张锋创立的、已经公开募股筹得9440万美元的公司Editas Medicine和杜
德娜创立的、获得诺华两轮共计8500万美元投资的公司Intellia Therapeutics。
近日，一封来自张峰实验室前工作人员林帅亮倒戈的邮件被公开，让CRISPR的专利之争
升级。这是一封带着求职意向... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 2 没用CRISPR作过动物。记得是直接注射sgRNA/Cas9 mRNA到受精卵里面？测DNA序列就是
尾巴拿一节下来提genomic DNA？这个过程我有点担心的是，Cas9是在受精卵水平就发
生了，还是在后面一段时间里都可能发生。我个人在细胞水平作的时候，有这个考虑，
就是Plamisd（含guide/Cas9/HDR-template)transfect到细胞之后，等了五天，再
split，然后等单克隆。我担心的就是一个细胞接受了plasmid，但这个cas9/HDR过程不
是马上发生，不等几天（我个人经验是expression plasmid表达的基因至少有四天往上
的活性）split，很可能挑出来的克隆是不单一的。
我五天后split，挑的单克隆里，有一个克隆至少后面confirm了，是一个single-
replacement/double-replacement的mix。这个之所以发现了，是因为single-
replacement的细胞最后长得快，过了两个月发现表型有些不一样，再作genotyping，
才确定的。回头看了我两个月前的genotyping图片，确实有一条很... 阅读全帖 |
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t*******w
发帖数: 107 | 3 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
FYI all.
Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
helpful
This paper raises important safety issue for gene therapy application of
CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
figure 3), you will not be able to find it in the genes! After ca... 阅读全帖 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 4 先发中文译文
Nature：CRISPR–Cas9基因编辑蘑菇问世，或“逃脱”了美国政府的监管
2016-04-18 测序中国
如今，利用CRISPR–Cas9基因编辑技术得到的工程化蘑菇已经开始种植并且售卖，而美
国农业部(US Department of Agriculture)目前并没有对这种新型的CRISPR–Cas9基因
编辑蘑菇进行管制，这或许意味着这种新型蘑菇并不需要进行监管机构的相关监管程序
来进行培养并且售卖，而首个CRISPR编辑的有机体或许已经接到了美国政府的绿灯指示。
来自中国科学院遗传学和发育生物学研究所的植物学家Caixia Gao表示，很多研究团体
将会因为这个新闻而非常高兴，而我们也很有信心看到多个基因编辑的作物不在监管范
围之内。宾夕法尼亚大学的科学家Yinong Yang指出，我们对常见的双孢蘑菇进行了基
因编辑使其能够抵抗蘑菇变为棕色，而这一效应通常是通过靶向作用编码多酚氧化酶（
PPO）的基因家族来实现的，多酚氧化酶是一种引发蘑菇变为褐色的酶类；通过剔除蘑
菇基因组的一系列碱基对，研究者Yang就敲除了6个PPO基因中的一个，从而就降低了该
酶3... 阅读全帖 |
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h*****G
发帖数: 113 | 5 只要是mamalian codon optimized的Cas9就可以，最好带GFP or antibiotic
selection，这样可以sort transfected的细胞。
Cas9-2A-GFP/Puro-U6/H1-gRNA的最好。
对于knock-in cassette, 如果你只是single or a few nucleotide mutation, 那么
最方便的应该是直接order single stranded DNA, 长度 ～ 100 nt. Homology arms >
40 nt 就足够了。
如果是要knockin比较大的insert，比如说GFP reporter，那么可以需要克隆到质粒上,
homology arm > 500 bp，就可以了。可以有antibiotic selection，也可以不用，取
决于你的效率。 效率低的情况用antibiotic selection，之后还需要一个step，用cre
-loxp把antibiotic selection cassette给去掉，否则在很多情况下会影响你gene的表
达。
在两种情况都要... 阅读全帖 |
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w********a
发帖数: 324 | 6 正在构建CRISPR/Cas9的vector做genome Editing。可是怎么都不work。
现在想先试一下Cas9 protein的 in vitro activity （targeting on 我们的 target
system），不知道各位知不知道市场上有没有commercially available的Cas9 protein
可以订购？
谢谢！ |
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a*****l
发帖数: 244 | 7 想用CRISPR在iPSC里搞point mutation，看了一下最简单粗暴的方法是合成Donor DNA
（100bp-200bp），合成gRNA ，然后买现成的Cas9蛋白直接搞。
听说 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成DNA 不错，但不知道哪里去合成gRNA
和买Cas9蛋白比较靠谱。具体来说，请教大家以下几个问题，希望大家多多指教！
1）gRNA去哪里合成？听说合成的RNA错误率比较高，还是让公司做 in vitro
transcription 更靠谱？
2） Donor DNA用双链还是单链比较好？
3） Cas9 蛋白在哪里买好？
最好是美国公司。谢谢大家！ |
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b******9
发帖数: 102 | 8 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
我个人觉得要注意以下几点：
1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。
6.donor载体我直接用的pBluescript SK(+)，转之前线性化处理一下。
7.阳性克隆鉴定有条件的话上southern，没条件用PCR吧，注意在同源臂外面设计引物。
8.再有就是防止细胞污染。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 9 Es cell 的话不要筛选太久、puro 两天就够了，电转后二十四小时开始加药，4天以后
就可以挑克隆了
质粒不用线性化也有很高的效率
: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性
率大概
: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
: 我个人觉得要注意以下几点：
: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在
同源臂
: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好
，做之
: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
: 5.转染... 阅读全帖 |
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w*****1
发帖数: 121 | 10 我们最近准备围绕crispr/cas9技术开发一系列的产品和服务体系，比如病毒包装业务
、靶向药筛、基因编辑治疗或CAR-T免疫治疗过程中的临床级病毒或T细胞体外扩增体系
等，这需要建立一系列的病毒库、稳转细胞库、转基因动物模型等。
目前我们已经可以开展一些简单的病毒包装服务，也有技术人员可以做转基因动物模型
，但仍需要有在crispr/cas9这块造诣较为深厚的技术领军人物能带领公司技术团队走
向更深入的应用研究。
我们公司在上海，有从体外到体内的完善技术平台，在全国范围内有较为丰富的临床资
源，如果确定了应用方向，需要大笔资金投入的话，我们也可以及时的引入风险资金。
要求：博士以上学历、拥有深厚的分子生物学背景，熟悉并精通crispr/cas9技术，至
少拥有3篇5分以上论著发表。
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薪资和股权激励方案，在保证生活稳定的基础上与你一起创业分享成功果实。我的微信
：xizhongzhu，Email:[email protected]/* */ |
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m****a
发帖数: 270 | 11 Cas9 表达得越久越多，当然 产生的 off target 越多。
这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白，明知故犯不
可思议。
但是一想也对，作者的动机不就是要 off target多好搞个大文章么？
应该去查查这几个人有没有在做空几个CRISPR相关股票。
看到过相关文献转染细胞24h的时候编辑大部分已经完成了，48h略有增加，48h到72h基
本没再增加。所以一般的protocol就推荐转染后两天split。
质粒的问题在于持续长时间的表达会增加off target 的概率。所以不如用蛋白，进入
细胞立即起作用，作用完以后就降解。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 12 “ 这篇文章最恶心的地方就是注射受精卵同时用了Cas9的质粒和Cas9 蛋白”
多加一个Cas9来源等于提高其表达水平，如果这都能make a huge difference,那本来
就证明这个系统不可靠。
蛋白在细胞里的寿命和从质粒上表达的多少是有很大波动空间的，纯质粒表达或者纯蛋
白注射在细胞里的浓度方差应该是不小的，那么也存在off target的风险。
比如两个一起用造成1000个突变和单个使用造成500个突变，在临床上都是不可靠。 |
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m********2
发帖数: 317 | 14 利用crispr-cas9 system使一个基因失去功能是一个最广泛的应用，但是反过来可以吗
? 即修复基因功能，比如一些cancer是由于单基因突变引起的，应用crispr-cas9
system能否修复这个突变呢?
如果可以的话，对少血液类肿瘤会有一定的应用前景。 |
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c*****u
发帖数: 439 | 15 挺好的文章。但是之前已经有人用shRNA做in vivo screen了，所以这个重要性可能就
没有特别大了，但是也许CRISPR的敲除更干净，所以能发现更多有意思的东西就不知道
了。
还有一个问题，其实AAV可以放下一个Cas9, 而且据说转染效率很高。这样的话，其实
可以AAV-Cas9 和 AAV-gRNA 一起打老鼠好了。 所以，没有必要做老鼠？ 也许我理解
有错误，对于AAV。 |
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l********n
发帖数: 62 | 16 请问各位大侠
像CRISPR/CAS9之类的基因编辑技术，从理论上讲，是否可以通过将癌突变位点修正的
方式治愈癌症？
用纳米微胶囊将CAS9蛋白deliver到癌细胞中，在理论上是否可行？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 （这个问题本来是放在另一网友的回帖里的，没有人注意或回答，就再拉出来示众。）
转化（transfection)效率低的话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个是siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题（不能超过十天左右），也就是transfection后不能等太长。而
CRISPR/cas9是permanent genome editing，没有时间问题；同时又不能保证
transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想... 阅读全帖 |
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s*******1
发帖数: 188 | 18 从addgene买的crispr/cas9质粒，转染我的目的细胞，效率极低。先后又从addgene购
买不同crispr/cas9质粒来转染我的目的细胞。效率都很低，小于1%。
于是自己对其中的一个质粒进行修饰，效果很好，达到50-80%。
请问我能对我修饰的质粒申请专利吗？
谢谢 |
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I****p
发帖数: 101 | 19 你这个观察（会被再切，一直到guide或PAM出现问题）确实很有意思。我想请教一下：
我们得到一共40几个转基因的很小个体（两个基因），都经过抗性筛选，但是测序后没
有一个有Indel。如果让这些小个体长大，有没有可能Cas9 表达量加大，最终出现
Indel?
起初怀疑，转基因插入到基因沉默区域，但是抗性基因却起作用，所以是其它原因了。
是向别人要来的载体，他们发文章说60-85% 的编辑频率，不知道要不要用Cas9 抗体看
看蛋白有没有表达。去做些无谓的Trouble Shooting真费劲，也许干脆换一个载体。
谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 如果我们要在哺乳动物细胞做原位knock-in,目前最好用的Cas9是哪个版本的? 我依稀
记得好像说是要用一种比较特殊设计的Cas9以及gRNA?
对于knock-in cassette, 在设计的时候需要注意什么？以及是否能在addgene 上要到
相关的质粒？ |
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m*****e
发帖数: 129 | 21 1 韩的方法最为简洁，方便。
2 他文章里用的cas9作为knockin的control，那个protocol也很clean。完全不用donor
plasmid， 直接合成flag/GFP containing gBlock，加上CAS9+gRNA， antibiotics筛
即可。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 22 从科学上，应该找出编辑（Knockout/in）效率和crispr/cas9表达强度之间，突变数目
和crispr/cas9表达强度之间的两种关系，然后找到最佳的保持高效率编辑和低风险突
变的表达水平。
药的剂量基本上也是这么确定的。
你强调编辑效率，文章强调风险，都没错，但是具体的平衡要做实验来决定。
我从局外人来看，任何新兴又流行的事物都会遵循一个社会学意义上的gardner's hype
cycle。crispr有过热的症状，现在可能是稍微熄点火的时候，很正常。
另外，请你举一个crispr/cas用来救垂危病人的例子。 |
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b*******0
发帖数: 125 | 24 比如说 把ob ob 小鼠 （leptin 点突变）通过 CRISPR-Cas9 搞瘦？ |
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b*******0
发帖数: 125 | 25 难道这不是 CRISPR-Cas9 的终极目的吗？ |
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j******i
发帖数: 939 | 26 作结构果然好发cns啊。什么蛋白热，就做什么。TALEN发了两science, cas9一science
一cell. 市义工和彦宁这回手慢了吧，估计也在做，但是慢了太多的话，只能发cell
research了。 |
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j******i
发帖数: 939 | 27 楼主看你的用户名也是做结构的吧！怎么没有解cas9啊。 |
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c**********n
发帖数: 177 | 28 哈哈，我只是个phd学生吧，只求做好份内工作毕业。Cas9这种大牛必争之地我老板也
不会去碰吧。结构确实是体力活，这个不能同意更多。对逻辑的训练远不如那些做
pathway的童鞋们。 |
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S***J
发帖数: 1210 | 29 cas9非结构的cns都多少篇了？我看含金量很多不如日本人的这篇cell。
science |
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f******g
发帖数: 1003 | 30 请问哪里能够买到CRISPR/Cas9小鼠文库（sgRNA).
或者有现成的软件设计sgRNA
谢谢 |
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f*******g
发帖数: 245 | 31 crisper/CAS9 究竟怎么工作？ homologous recombination ? or RNAi ? |
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w********a
发帖数: 324 | 32 Cas9 double strand breakage以后是否跟其他的restriction enzyme 酶切一样，还带
有5‘-phosphate？ 如果是，如何验证？谢谢！ |
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w*********n
发帖数: 439 | 33 各位大侠，小弟刚开始学做Crispr
请问如果要使用homolog Arm做HEJ的话该用Cas9还是Cas9D10A? |
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k*****n
发帖数: 323 | 34 如果你的homolog后有selection marker的话，用d10a。没有的话，还是wt cas9吧 |
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j*****3
发帖数: 1 | 35 生信背景，问个小白问题：有大约40多种CAS蛋白，其中有更universal的CAS1，2,还有
更短小的，但为何选用CAS9构建CRSPR系统？
另，CRISPR跟真核的SINE很像啊，都是间隔重复，或许真核也存在SINE关联蛋白，也能
行使CRISPR/CAS的功能呢？ |
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a*****i
发帖数: 2108 | 36 还有Feng Zhang和doudna的矛盾？不得不说CAS9这玩意儿确实好用，亲身体验啊，感觉
又是个诺奖大热。 |
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a*****i
发帖数: 2108 | 37 还有Feng Zhang和doudna的矛盾？不得不说CAS9这玩意儿确实好用，亲身体验啊，感觉
又是个诺奖大热。 |
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z*********t
发帖数: 105 | 38 90%的古菌里都含有自己的CRISPR/Cas系统，现在用CRISPR/Cas9技术已经实现了在多种
模式生物里进行基因组编辑，有人用它来在古菌里进行knockout吗？ |
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j******i
发帖数: 939 | 40 干细胞，体内等，都需要virus才能高效进去。对于cas9的应用，virus可以控制MOI,
transfection一转就是一坨。估计大家一看这个问题，就在纳闷是哪个新phd学生在提
问。。。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 41 嘿嘿，cas9对我就是生物对新Ph.D.么。：）。
对需要transfection效率需要高的体系，你说的体内可以理解。对少数细胞系因
transfection效率低，不是可以筛选吗？
“一转就是一坨”是只转进去的DNA太多，怕off-target? |
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m*********D
发帖数: 1727 | 42 你是问那个library的availability吧？我也感兴趣。
我倒是觉得genome screening不是大问题。如果一个细胞里进去3-5个guide seq.，三
五个基因knockout,外加off-target,一deep seq,基本就知道了对象。这个思维在没有
好的合适自动化的high-throughput screening的时候，一个样品里加十个compounds,
有了效应在一个一个分析差不多。倒是用这样的library,细胞的转化效率确实要考虑。
不用virus delivery,效率低，会比较麻烦。
mousemice网友说的有些细胞对筛选敏感我自己体会过。我用的deliver方式是有25-50%
的细胞能被transfected。但我筛选后只有大约1%细胞survive。以前和这里一个网友交
流时，他/她用sorting，也是1%。我想很多transfected细胞也许表达量不足，过不料
筛选这关。不知道cas9的表达量和genome edit的效应的平衡点如何，太多会有太多off
-target,太少连自己的target也切不了。估计也是不同细胞不一样。... 阅读全帖 |
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M******g
发帖数: 152 | 44 You can try cas9 from New England Biolabs. |
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l********e
发帖数: 415 | 45 d10a不好用，建议wildtype CAS9 |
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Q*****G
发帖数: 638 | 46 Thanks a lot!
Have already tried wt cas9, worry about higher off target effect. |
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h*******u
发帖数: 126 | 47 请教各位大牛，我们用CRISPR/CAS9腺病毒敲除基因，在纯化之前的检测PCR和T7EN1有
效果，而用腺病毒纯化试剂盒纯化以后，就不能够切割DNA了？试了两种不同的试剂盒
都是这样，着急死了，怎么回事呢？ 谢谢各位！ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 48 假设Cas9已经在DNA上切了一刀了，那么究竟是添加或者去除1，2,3个碱基是完全随机
的吗？如果是这样，不是意味着有三分之一的可能性不会移码突变？
如果以上猜测正确，能否表达多个sgRNA在一个基因上不同的位置编辑从而提高移码突
变的可能性？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 49 我用了两个DSB，有没有indel自然一目了然了。另外，只作indel,直接连回去的，只要
还有guide/cas9,往往会被再切，一直到guide或PAM出现问题。 |
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f**l
发帖数: 22 | 50 看rudolf jaenisch的文章，建议加selection marker，HR arm 别弄得太短，普通cas9
可以用，有些construct可以从addgene买到 |
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