U**l
发帖数: 153 | 1 不知道大家有没有注意这文章的timeline:
Received: January 22, 2014
Revised: February 2, 2014
Accepted: February 2, 2014
Published: February 13, 2014
估计情况这酱紫的：
文章一投出去，小张同学就直接和cell editor挂了个电话。editor立马抓了三个好哥
们，要求他们三天之内给我把这文章给收了。其中一哥们说俺们做人不能这么没准则，
所以顶住压力拖了10天写了几条小改建议。editor一边教训这哥们，一边连夜把review
comments发给了小张同学。小张同学几小时写完了reponse发给日本那边，没想到时差
问题，于是一不小心又拖了一天。这就来到了2月2日（开春二月二，确实是好日子！）
，日本那边发回给了cell editor，是这边半夜时间，cell editor连夜就把文章收了（
所以accept和revised同一天），后面又和排版的那些人较了会劲，终于13号上了网络
。。。 |
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w*****r
发帖数: 2061 | 2 CRISPR比TALEN简单多了
都是RNA guide，off-targeting跟shRNA差不多吧，不知道Cas9 nuclease没有guide的
话，活性怎么样 |
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a******a
发帖数: 283 | 3 Genome editing The Berkeley and San Francisco campuses of the University of
California have announced a US$12-million project focused on the CRISPR/Cas9
gene-editing technology, the powerful technique that allows targeted
rewriting of genomes (see Nature http://doi.org/rz6; 2014). The Innovative Genomics Initiative will receive $10 million from the Li Ka Shing Foundation in Hong Kong, with the rest made up by the two universities. Jennifer Doudna, the Berkeley-based executive director of the ini... 阅读全帖 |
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y***y
发帖数: 709 | 4 也准备上CRISPR的人搭车问一下
怎么从设计的三个sgRNA里面筛选到效率高呢？
把gblock合成好之后，分别和cas9质粒共转染然后做RFLP吗？
还是收蛋白看目的基因的表达情况？
我要做的是成纤维细胞，转染效率很低，不知道在低转染效率的情况下如何筛选到效率
高的sgRNA，希望得到有经验人的指点。 |
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y***y
发帖数: 709 | 5 也有看到这个系统了
可是我担心cas9留在基因组中可能会对细胞有影响吧 |
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d****i
发帖数: 2346 | 6
你是不是说用TAT一类肽引导进去？发一篇文章没问题。但是我个人觉得没多大优势，
因为现在已经把cas9和gRNA做到一个载体里面了，即使你把蛋白直接弄进细胞，还是要
转染gRNA的plasmid。 |
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l***y
发帖数: 638 | 8 cas9挺大的蛋白
效率是关键
这么折腾有啥优势？ |
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i*****i
发帖数: 154 | 9 可不可以先做一个Cas9稳定表达的细胞，然后把gRNA像siRNA那样transfection进去？
理论上差不多，gRNA是单链，siRNA是双链。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 13
有用过这个设计工具的同学吗？有效率大概多少？ |
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f******g
发帖数: 1003 | 14 同问，每个基因４条sgRNA够吗?
off－target高吗? |
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s********n
发帖数: 248 | 15 每个locus/每个基因不同gRNA target效率都有所差别，如果想合成RNA用来打老鼠，可
以先在N2a 细胞里测试一下gRNA target的效率，再选择target效率高的用来打老鼠。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 16 做screen的话，addgene上已经有mouse的库了。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 17 谢谢你的回复，我搜了一下，没有找到小鼠的sgRNA文库，只找到人的，
Human Lentiviral sgRNA Library - Cell Cycle (Plasmid #51046)
Human Lentiviral sgRNA Library - Nuclear (Plasmid #51047)
能耽误你几分钟的时间，贴的链接吗，谢谢 |
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f******g
发帖数: 1003 | 22 High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics
in human cells
Yuexin Zhou, Shiyou Zhu, Changzu Cai, Pengfei Yuan, Chunmei
Li, Yanyi Huang & Wensheng Wei
ZMYND11 links histone H3.3K36me3 to transcription elongation and tumour
suppression
Hong Wen, Yuanyuan Li, Yuanxin Xi, Shiming Jiang, Sabrina
Stratton, Danni Peng, Kaori Tanaka, Yongfeng Ren, Zheng Xia,
Jun Wu, Bing Li, Michelle C. Barton, Wei Li... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 1125 | 23
你是黑我呢吧..我一吊丝哪里摸过普林的门框...
xiao dong 自己的独门生化绝技＋眼光／运气在合适的时期进入了细胞凋亡这个领域（
原来的领域SREBP已经很牛了，但是那个领域想出更大的突破很难了，毕竟薄后祖师爷
压着呢），体外系统对于整个领域对于凋亡的机制理解有很大的促进作用。
但是我个人对于把xiao dong吹上天什么诺奖囊中之物／必然会得之类的言论觉得比较
好笑，因为这种话大多都是国人口中出来得。这个相关领域贡献跟xiaodong差不多的最
起码有好几位，诺奖最多给三个，这个谁能保证xiaodong 一定得呢..
“国内90%的课题组做无用功，国际上根本无人知道，这个也有小东的很大的责任吧。”
－－这个我不知道你的证据和结论都是哪里来的...国内研究水平水涨船高，也作出了
不少国际知名得成果。
你要是非较真说诺奖级别的才算“成功”，那国内现在达到这个水准得确实没有，但是
罗马不是一日建成得，总有个过程对吧？
我支持你的部分观点是 国内过分注重大文章／因子，导致了很多国内研究一窝蜂做热
门／好发大文章领域（干细胞，表观，结构），所以这些年国内CNS或者子刊级别文章
越来越... 阅读全帖 |
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s***k
发帖数: 31 | 24 欢迎大家参加哈佛医学院华人生命科学年会， 本届年会邀请了各专业领域卓有成就的
教授、临床医生和生命科学产业界的领军人物主讲，会议选题广，涵盖了各学科的最新
进展和研究热点。
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Free food and drinks will be reserved for the registered attendees.
“Neuroscience”– CLARITY technology, large-scale EM technology, and
genetic mapping
Dr. Qiufu Ma Professor, Da... 阅读全帖 |
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b***2
发帖数: 348 | 25 你自己愿意纯化蛋白的话，addgene上有质粒，自己表达.ID: 39312 |
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w********a
发帖数: 324 | 26 多谢！
我们request了这个质粒，准备自己纯化。但是我们没有蛋白纯化的基础，所以，如果
有现成的话，就想直接花钱买了。
你试过吗？用他们的这个质粒以及他们的protocol，纯化的效果如何？ |
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b***2
发帖数: 348 | 28 我同实验室的做过。你如果不是要求很纯的话，问题不大，方法也简单。如果你要求高
纯度的话，没有基础估计有点困难。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 31 这是史上最容易上手的genome editing技术了吧，不work的话也不用troubleshoot这种
in vitro cutting activity吧，只要序列没错怎样都能cut的啊
target
protein |
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h*******s
发帖数: 327 | 32 Doudna 实验室其实很久都没成功做出editing来。
后来Jan.3,zhang 和church lab两篇science online.
1月底elife才出来，质量不仅是最差，而且是差的很多很多。
说是那个月赶出来的，我都不会奇怪。
2012的science，只是biochemistry而已，跟editing差的远了。而且是两个lab一起做
的。真正开创性的源头，还不如说另外一个lab一年前nature发现了cas9。
始。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 34 抗生素和疫苗，拯救了几十亿人的生命，是现代医学的基础
特殊菌种的培育，，使得玉米棒子，植物秸秆中的多糖可以转化酒精，可大大缓解甚至
将来可以解决能源危机。
质粒的发现简直是分子生物学的基石，目前蛋白纯化，基因测序，转基因技术都无不来
源于它。
目前Cas9的发现，又开启了另一个genomic editing一个新纪元。
欢迎大家补充。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 35 CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.
Yang L1, Yang JL, Byrne S, Pan J, Church GM.
PMID: 24984853
Please send to [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,2),16)^r;s+=String.fromCharCode(c);}s=document.createTextNode(s);l.parentNode.replaceChild(s,l);}}catch(e){}})();
/* ]]> */
... 阅读全帖 |
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c****r
发帖数: 9 | 36 Two postdoctoral positions are available immediately at Texas Tech
University Health Science Center at El Paso. The major interests of our lab
are: 1. Using a new approach developed in our lab to study how pri-miRNAs
are recognized and processed (PNAS 2013, 110: 20687–92). 2. We have
independently developed a CRISPR-Cas9 system-based strategy to perform
genome-wide knockout screening to study various biology processes (
unpublished, more information can be found at: http://www.ttuhsc.edu/foste... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 37 A postdoctoral fellow position is available in the lab of pediatric
nephrology in the Department of Pediatrics and Communicable Diseases at the
University of Michigan, Ann Arbor, MI.
The postdoctoral fellow will be working on projects using in vitro cell
culture and rodent models to study renal glomerular function and related
diseases. The research projects involve the generation of transgenic cell
lines using the CRISPR Cas9 system; generation and maintenance of rodent
models of kidney diseases... 阅读全帖 |
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z****u
发帖数: 1007 | 38 南京动物所做个CRISP/CAS9 KO要10万人民币，还是目前优惠价。
这边我们这里core facility 同样的东西以内部价格可以不到1万美元搞定。 |
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r******k
发帖数: 446 | 39 如题。 小弟想想做cell line的KI。不知道哪位大神做过？ 质粒我都拿到了。 不知道
大家都用什么样的protocol呢？
非常感谢 |
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l*********i
发帖数: 332 | 41 ssDNA oligo as donor, puro screen, should be easy~ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 42 楼上二位能不能多分享一些经验？
具体讲讲要注意点啥 |
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l*********i
发帖数: 332 | 46 zhang feng的nature protocol写的如此详细，看看去啊 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 48 Thanks a lot! Just assigned by my boss to develop this technology for the
lab. |
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j******i
发帖数: 939 | 50 转染效率跟哪种细胞有关。CRISPR+ssDNA要拿到想要的克隆还是挺费劲的。可以考虑
CRISPR+piggybac＋puroTK的结合来筛选克隆。 |
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