m*********D
发帖数: 1727 | 1 我的问题不一样：为啥要用virus delivery system呢？转化（transfection)效率低的
话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题，transfection后不能等太长。而cas9是permanent deletion，又不
能保证transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal tran... 阅读全帖 |
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b*****m
发帖数: 438 | 2 Pls send email to [email protected]
/* */ Thanks a lot!
All the following papers needed are published on Molecular Cell, 21 May 2015
issue.
1. Calibrating ChIP-Seq with Nucleosomal Internal Standards to Measure
Histone Modification Density Genome Wide
Adrian T. Grzybowski | Zhonglei Chen | Alexander J. Ruthenburg
2. Toward Whole-Transcriptome Editing with CRISPR-Cas9
Dirk Heckl | Emmanuelle Charpentier
3. Single-Cell Transcriptomics Enters the Age of Mass Production
Jan Philipp Junker | Al... 阅读全帖 |
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v********a
发帖数: 646 | 3 Scientific Manager – Stem Cell (Job 34333)
Are you interested in pioneering Stem Cell Research? We are seeking a
Scientific Manager for the new Developmental Neurobiology Stem Cell
Laboratory. As the Scientific Manager you will lead collaborative research
projects with investigators in the Developmental Neurobiology Department.
The Scientific Manager will be responsible for:
· Developing new differentiation protocols aligned with the
research interests in the department.
· Modeli... 阅读全帖 |
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l*******e
发帖数: 170 | 4 没有一手经验，貌似Feng lab的lentiCRISPR v2不错，但是看描述又说lentiGuide-
Puro双质粒系统可以得到更高的virus titer，但是必须用稳定表达Cas9的细胞系做实
验。
有经验的同学给说说，或者其他的什么系统更好。
我感觉做screening的话障碍有两个，一个是infection efficiency，二是off-
targetting effect.
另外哪里有稳定表达Cas9的细胞系卖，比如293什么的？ |
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O**********a
发帖数: 317 | 5 v2有两种，一种是cas9和gRNA分开的，先建stable cell line表达cas9，再用lenti-
gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：大谢！
：
：........... |
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m*********D
发帖数: 1727 | 6 他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天。
要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
你说的先作Cas9的stable我要考虑一下。就是作stable cell line太花时间。Cas9的表
达silence问题该不大。一般stable在我手里是三个月之后才出现基因表达走下坡。
Lentivirus感染效率高的话，一个vector省很多事啊。上次作点突变，我用普通的
lipofectamine 3000作transfection, 效率太差，少于10%的细胞能在三天的puromycin
selection后活下来。也许我用的puromycin量太高，2.5ug/ml。当时作了一个三天的
killing，找到能三天杀完host cell的最低量，就用上了。
再向你请教一下：vector整合进genome后，拿到genomic DNA，再用primers来扩增整合
的guide Sequences。这对PCR primers 就是直接从vector来的吗？我想象这对primers
正好在gu... 阅读全帖 |
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O**********a
发帖数: 317 | 7 请教真不敢当，你是前辈。
我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
合在一个载体的也可以，如果你喜欢。看你偏好了。
建stable cell line也不难啊，两到三周。
我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章，说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天
。要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
：
：........... |
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O**********a
发帖数: 317 | 8 我现在有Cas9的老鼠，想敲掉一个基因，用HDR模版引入点突变。准备直接注射卵；因
为有Cas9老鼠，所以只需要注射gRNA＋HDR template。
设计好了gRNA，是必须构建载体用T7加酶体外转录获得吗？
为了简便，我考虑直接合成gRNA＋scaffold RNA。加起来有104 mer，是不是不可行？
这个长度的RNA能直接合成吗？是不是会很贵？
非常感谢！ |
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S***J
发帖数: 1210 | 9 Lander的文章确实有故意拔高Feng zhang的嫌疑，给了大段的煽情描述，不过Zhang在
Crispr用于genome editing方面，绝对是贡献最大的。
但是不管是不是拔高了Zhang，Doudna的贡献并没有被贬低。她绝对是个抢credit的好
手，整天的给自己打广告，恨不得抓住机会就说她是发现者，呵呵。Crispr这个系统的
基本生物学问题Doudna没有贡献，她只做了纯生化的工作。然而她的这篇唯一的重要文
章，还是Charpentier领头做出来的（doudna只是次要共通讯作者）。
crispr的发现过程和其生物学问题，zhang和doudna都没有任何贡献。现在问题的核心
就是，谁是最先用crispr做的genome editing？目前zhang和doudna的专利之争，也是
关于这个方面。目前的小道消息是，zhang绝对早于doudna和charpentier，有很清楚的
notebook为证据。据说这也是为什么Lander敢发表这篇文章的原因，因为他们已经确信
能够赢下这个专利之争。
至于得诺奖，看怎么分。如果是genome editing发奖，估计要包括... 阅读全帖 |
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c****1
发帖数: 1095 | 11 非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
effiency |
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c****r
发帖数: 9 | 12 A postdoctoral position is available immediately at Texas Tech University
Health Science Center at El Paso. The major interests of our lab are: 1. We
have independently developed a CRISPR-Cas9 system-based strategy to perform
genome-wide knockout screening to study various biology processes (Cell Rep
2015,12(4):673-83). 2. Using a new approach developed in our lab to study
how pri-miRNAs are recognized and processed (PNAS 2013, 110: 20687–92). 3.
Optimizing CRISPR-Cas9 system (Genome Biology 201... 阅读全帖 |
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x****6
发帖数: 4339 | 13 1）我觉得现在来讲临床应用有点太早，就算是已经被MIT,伯克利这种顶级学院研究了
几年的crispr/cas9都还没有奢望临床应用。
更何况，就如同crispr/cas9现在正在被修改、优化，这个系统也可以被修改和优化。
我自己对蛋白质定向进化比较熟悉，完全可以设想对这个蛋白进行大规模突变，来寻找
只识别带有DNA 5'特殊、人工修饰（比如乙酰化，在生物里不存在）的ssDNA的突变子
，来降低off targeting的风险。
2）关于iPS的意义我和你的理解不太一样。我认为主要不在理论，而在于实现的结果。
据我一个听过山中申弥讲座的朋友介绍，当时有人问他怎么找到那四个TF的，他说完全
是试出来的，试了N多，最后运气好，出来了。就是到现在也没有一个convincing的理
论来解释。那么既然是结果重要，那么这个工作的意义在于1）为研究发育提供了技术
平台，比如james thomson现在基本该行去做老板，开了个cellular dynamics,专门卖
ips的细胞系；2）对于再生医学的临床应用的潜在意义：用病人自己的组织诱导培养出
脏器，移植给自己。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 技术的东西等时机时间积累到了，就需要灵光一闪，然后执行，比如PCR，比如CAs9等
后期的改造，但是CAs9等的早期，肿瘤呀，再生呀，精准呀等等，可不是这么回事，靠
野路子就可以....王俊的忽悠能力肯定很强，但更重要，在right time right place..
.Craig同志可不是这样....积累沉淀还是很不一样的，土豪与贵族还是有很大区别，因
此未来也会有不同...当然不排除土豪可以变贵族，这个就看骨子里的基因了... |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 事情发展到这个地步，其实对张峰，多得娜和教堂都不利。因为如果最后大家都不用
Cas9了，就不会给这个技术单独发奖，那么发奖的时候就只会发给卡朋特一个人，另外
几人都没有份。就象前年发那个超微成像的时候，如果是单独发PALM, 就没有办法绕过
晓薇的STORM，结果人家一下子拉来另外两个技术一起发，每个技术只发一个人，所以
就理直气壮的把晓薇踢出去了。如果这个事情也是出现这个思路的话，那么如上面有人
指出的那样，四个技术（ZFN,TALEN,Cas9,NgAgo) 只能发三个。这样的话很可能牺牲的
是TALEN。因为TALEN 技术生不逢时，既不是最早的，也不是最好用的，对生物技术的
进展几乎没有特别显著的贡献。 |
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g****g
发帖数: 74 | 16 内行啊
这个NgAgo脱八律是否真的很低，还需要后面很多的验证，仅凭那篇文章就下结论为时
太早
而且其实用rna的特异性／稳定性应该也是比ss－5p－dna好的，不知道那篇文章为什么
说dna比rna好
再说，其实有pam的限制，反而是好事，何况现在有那么多版本的cas9 pam varants，
个人觉得cas9还是远胜ngago 的
病 |
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j******i
发帖数: 939 | 17 其实吧 韩老师是取了个巧 可以发个好文章 但实用性方面没法取代CRISPR/Cas9 虽然
可以在有些地方起补充作用 CRISPR/Cas9太方便太好用了 以至于大多数科学家潜意识
里都认为没有再找一个基因编辑系统的必要 这个也只有远在深山的韩老师才能跳出这
个主流意识束缚
这个工作当然是原创 而且是非常漂亮的原创 不能因为这个工作受到CRISPR和65度活性
的Ago启发就否定原创性 所有的工作都是based on something的嘛 国内宣传火 也是因
为国内原创的东西还是太少了
那么其他科学家在想什么呢 做基础研究的 忙着用CRISPR做ko细胞系动物模型 做
screening 做转化的在想 如何deliver 如何提高同源重组的效率－不能光切一下DNA就
了事了啊 基因编辑转化临床应用最大的两个困境也是一直以来的困境就是deliver和提
高同源重组的方法 NgAgo是CRISPR的很好补充 但是 它的出现改变了什么吗 基本没有
以前可以轻松做到的还是可以轻松做到 以前困难的现在还是一样困难 但是 可以发好
文章 因为这个概念新 虽然没有解决老问题 |
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l***s
发帖数: 841 | 18 Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
cells |
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发帖数: 1 | 19 我比较希望韩春雨是因为隐藏了某些东西而导致大家无法重复。但是这种可能性很小，
实话实说，自从CRISPR-Cas9的出现就已经大大的降低了基因编辑的门槛，至少从基因
编辑的原理来说，不可能复杂到哪里去。基因编辑的过程就是给细胞提供分子剪刀和修
复模板，你的NgAgo通过载体运到细胞内部表达不可能比Cas9还要困难（如果你的文章
中用的NgAgo是你导入了某些突变的话，你并没有在文章中提及，而故意给大家发放错
误的质粒，我不知道这个大家该怎么看，至少作为一个人正常人都不会这么干的吧）。
另外5‘-P-ssDNA的运输进细胞也不可能会比90bp长的ssODN困难。唯一可以隐瞒的就是
如何降低5‘-P-ssDNA对细胞的毒性。不管怎么看，这篇文章都很weired。从他在北京
大学做报告来看，讲得确实很烂，不像是一个受过正规训练的科研工作者。 |
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a*****i
发帖数: 2108 | 20 是的，这也是我此帖想说明的意思。其实不光是国内，国外一个意思，哪里有人哪里就
有江湖。Cas9这么好用的东西，仨巨头还不是为个IP争得你死我活。
作为一个看客，以及有幸用过Cas9并受益过的人，我从来要表达的就是大家现在没必要
这么早下结论，再观望一段时间，事实就越来越solid了。倒是一帮外行在这上蹿下跳
的，见到不同意见就给盖水军帽子，一副红卫兵作态，实在是辣眼睛。
我根本就不担心这事最后会有个盖棺定论，因为这个东西太火了，当全世界目光都在你
身上的时候，事实真相只是个时间问题。 |
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n**********g
发帖数: 196 | 21 1) I have no comments, but Dr. Chou has mentioned he was able to reproduce
it.
The biggest concern is not addressed by your answer.
2) DNA band and migration are easily alternated by sample ionic strength and
buffer.
No, I did not talk about band distortion. Read my question carefully. Fig 4a
and Fig 4e. No shift when cleavage sites are 30bp and then clear shift when
cleavage sites are closer.
3) Visualization/staining and capture will add non-linear effects to DNA
quantitation. Un-even chemical... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 22 I was a nucleic acid research scientist, but not working on gene editing any
more
. The reason I am involved is to present some basic knowledge on nucleic
acid
research.
{1) I have no comments, but Dr. Chou has mentioned he was able to reproduce
it.
The biggest concern is not addressed by your answer. }
Band shift sometimes can be seen due to sample ionic strength and buffer.
{ 2) DNA band and migration are easily alternated by sample ionic strength
and
buffer.
No, I did not talk about band dist... 阅读全帖 |
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h*****t
发帖数: 64 | 23 Two postdoctoral positions are available immediately at Texas Tech
University Health Science Center at El Paso. The major interests of our lab
are:
1. We have independently developed a CRISPR-Cas9 system-based strategy
to perform genome-wide knockout screening to study various biology processes
(Cell Rep 2015,12(4):673-83).
2. Using a new approach developed in our lab to study how pri-miRNAs are
recognized and processed (PNAS 2013, 110: 20687–92).
3. Optimizing CRISPR-Cas9 system (Genome Biology... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 24 国际转基因技术协会原主席Montoliu博士建议不要再试图重复韩春雨实验结果
澳大利亚国立大学Gaetan Burgion今天撰写长文介绍他试图重复河北科大韩
春雨创立的NgAgo基因编辑技术的经过，得出结论：韩春雨的实验无法重复，而
且与韩在论文所说矛盾；《自然·生物技术》应要求韩公布原始数据；该技术显
然没有前途。
国际转基因技术协会创建者和原主席Lluis Montoliu博士根据这一结果以
及其本人实验室的实验结果，向国际转基因技术协会会员发出一封公开信，建议
停止继续试图验证韩春雨的实验，不要再浪费时间、金钱、人员和项目。
CRISPR谷歌群针对这项技术和韩春雨的文章的调查表明，140个调查回复中，
只有一个（中国神经所仇子龙？）回答该技术起作用，73个回答无效，63个回答
在验证。
From: [email protected]/* */ on behalf of Lluis
Montoliu To: ISTT List
Subject: [ISTT_list] Great disappointment with Ago: Long life to
CRISPR... 阅读全帖 |
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y****i
发帖数: 2108 | 26 "网红"学者韩春雨:正在持续实验 将适时公开验证
2016年08月02日21:23:35 [新闻大杂烩]
中国学者韩春雨团队的诺奖级实验，近日引起一些人质疑。质疑者认为这种新的基因编
辑技术不能重复试验，为此围攻韩春雨为“造假者”，但拥挤韩春雨的也大有人在。针
对这些激烈讨论，“中国网事”记者展开调查。Mitbbs.com
2016年5月2日，河北科技大学副教授韩春雨作为通讯作者在国际顶级期刊《自然·生物
技术》（Nature Biotechnology）杂志上发表了一篇研究成果。他的团队发明了一种
新的基因编辑技术——NgAgo－gDNA，向已有的最时兴技术CRISPR－Cas9发起了挑战。
CRISPR－Cas9被认为是第三代基因编辑技术，近些年来一直是诺贝尔奖的热门。Mitbbs
.com
此后，韩春雨被媒体广泛关注，被网民称为“网红”科学家，并被广大网民誉为“寒门
”学者的典范。Mitbbs.com
此后不久，有人提出韩春雨的试验无法重复，有人说可以重复，争论不休、难有定论。
7月29日，此前曾宣布可以重复韩春雨实验结果的澳大利亚国立大学研究者盖坦·布尔
焦称，尽管他和同事在过... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 27 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
引子
我们生活在一个幸运的时代，我们生活在一个变化的时代。
历史就在我们每一天不经意的时候悄悄地留了下来。
世界各地的2016年都不同寻常，记录一下有些瞬间即逝的印记。
Ago 和CRISPR/Cas 是两个世代相传的家族，各自有各自的功能，各自在各自
的地盘上行使着自己的职责。
CRISPR/Cas率先冲出功能区禁锢，领跑出了基因组编辑的新天地。
Ago家族呢？有没有也隐藏着可以编辑基因组的黑马？
2014年2月，荷兰John van der Oost组在Nature杂志上发表了关于Ago家族
成员TtAgo的研究，为Ago功能区域拓展，照进了一线光亮。
2016年5月，中国的韩春雨组在Nature Biotechnology 杂志上，发表了关于
这个家族成员NgAgo的科研论文，用实验数据论证，NgAgo就是Ago家族基因组
编辑的一匹黑马，而且是一匹可以与CRISPR/Cas9 齐头并进的黑马。
俗话说，是骡子是马，拉出来溜溜才能分得清。
任何此类“发现”，特别是带有工具性质的技术，一旦以科研论文形式发表，
就会被世界各地的业界同仁们重复实验... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 28 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 29 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
引子
我们生活在一个幸运的时代，我们生活在一个变化的时代。
历史就在我们每一天不经意的时候悄悄地留了下来。
世界各地的2016年都不同寻常，记录一下有些瞬间即逝的印记。
Ago 和CRISPR/Cas 是两个世代相传的家族，各自有各自的功能，各自在各自
的地盘上行使着自己的职责。
CRISPR/Cas率先冲出功能区禁锢，领跑出了基因组编辑的新天地。
Ago家族呢？有没有也隐藏着可以编辑基因组的黑马？
2014年2月，荷兰John van der Oost组在Nature杂志上发表了关于Ago家族
成员TtAgo的研究，为Ago功能区域拓展，照进了一线光亮。
2016年5月，中国的韩春雨组在Nature Biotechnology 杂志上，发表了关于
这个家族成员NgAgo的科研论文，用实验数据论证，NgAgo就是Ago家族基因组
编辑的一匹黑马，而且是一匹可以与CRISPR/Cas9 齐头并进的黑马。
俗话说，是骡子是马，拉出来溜溜才能分得清。
任何此类“发现”，特别是带有工具性质的技术，一旦以科研论文形式发表，
就会被世界各地的业界同仁们重复实验... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 30 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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x****6
发帖数: 4339 | 31 近5年，随着crispr/cas9的技术越来越成熟，它被越来越多的人关注，影响力延伸到普
罗大众。在学术界，这门技术已经普及；在工业界，一系列初创公司应运而生，以
editas为代表，它已经通过第二轮融资，已然是生技初创公司的巨无霸。
在承认它在提高基因编辑，特别是在高等生物里，起到巨大作用的同时，我不禁要问：
它到底解决了什么实际问题？
Genotype-phenotype mapping仍然是一个巨大的黑匣子，我想在未来的几代科学家这个
时间尺度内都将不会改变。人类/动物基因组编码序列就是本天书，现在基本上是看不
懂的；而绝大多数表型，包括疾病，都是多因子影响的。连书都没看懂，怎么去朝着特
定目标去搞修？！请不要举乳腺癌等单基因个例来反驳我，我是在全局的角度说事。
看看当初吊足了科学界和大众口味的ENCODE，一个举国（际）体制项目，就是想搞清基
因组测序之后有什么用。最后只能骗骗看热闹的外行，而在业内早已沦为笑柄，甚至都
有科学家出书来埋汰它。
我认为crispr/cas9是一个极其方便的perturbation tool,能够来帮助我们探索
Genotype-phenotype... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 32 从他的话语中，可以比较清晰的读出，NgAgo不稳定，需要优化改善，但是等不到技术
优化了才发文章。这就变相的承认了他文章中的数据是编出来的，所有的高效率的结果
都是假的。
他还说CRISPR-Cas9在开始的时候也是效率不到1%，话里的意思是现在NgAgo的效率就是
非常非常低（如果起作用的话），那么他文章中跟CRISPR-Cas9做比较的数据就一定是
假的了。这点没有任何疑问。
另外，请那个Yue Dongxiao不要再出来丢人现眼了。 |
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h*****t
发帖数: 64 | 33 关于艾滋病功能性治愈的项目，涉及到人源化小鼠，需要有很强小鼠操作能力，比如尾
静脉注射三周小鼠，眼底采血需要两到三周一次，连续采集十二次左右。能力突出的，
硕士学位也可以。年薪大约41K，但可根据工作经历调整。
之前要招的两个位置也没有招满，可以继续申请。
Two postdoctoral positions are available immediately at Texas Tech
University Health Science Center at El Paso. The major interests of our lab
are:
1. We have independently developed a CRISPR-Cas9 system-based strategy
to perform genome-wide knockout screening to study various biology processes
(Cell Rep 2015,12(4):673-83).
2. Using a new approach developed in our lab ... 阅读全帖 |
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c****y
发帖数: 14 | 34 美国三院（美国科学院、美国艺术与科学院、美国医学院）院士Carlo M. Croce教
授在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/国家生物治疗协同创新中心建立实验
室，开展肿瘤学方面的研究，通过基因组学、生物信息学、细胞生物学和遗传学方法，
筛选、鉴定新型的肿瘤标记物，特别是非编码RNA，阐明其在肿瘤发生发展中的分子作
用机制。利用CRSPR-Cas9进行基因编辑，在动物模型中证明新基因的功能。因科研需要
，拟公开招聘博士后研究人员。博士后入站后，先到美国俄亥俄州立大学综合癌症中心
进行科研，然后回到四川大学生物治疗国家重点实验室继续进行博士后科研。
应聘条件：
1.具有扎实的的细胞生物学和分子生物学知识和训练，熟练掌握相关实验技术，对肿瘤
学和基因表达调控具有浓厚科研兴趣；
2.已获得国内外高水平大学博士学位，能独立从事科研工作，具有良好的英文阅读、写
作和交流能力，并以第一作者身份发表过SCI研究论文；
3.具有CRISPR-Cas9和动物研究经历者优先；
岗位职责：
1.加入创新研究团队，积极申报和承担各类科研项目，开展卓有成效的科研工作，发表
高水平的学术论文；
2.... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 35 韩红了主要是因为科研屌丝的身份＋重要成果的反差形成的新闻价值。NgAgo本身不会
那么火，基因编辑已经有了几乎完美的工具。NgAgo在技术层面上并没有突破，完全没
有像zfn,talen,crispr／cas9刚出来时，那种给人横空出世的感觉。这点也适用于后来
出现的cpf1,saCas9等其他基因编辑系统－大家已经对crispr/cas9很满意了，对于后来
出现的工具，基本反应就是－哦，又一个crispr。这也是国际上刚开始并没有什么反应
的根本原因。再者，NgAgo挂上国产的标签，也让其新闻价值爆表。 |
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c********n
发帖数: 225 | 36 Date：2016年07月20日（NBT paper 上线两个半月以后）
Title：仇子龙的声明
Link:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32030017.html
Key Points：
- 从声明的内容来看，仇子龙实验室没有能够重复出韩春雨NBT文章中的结果；
- 但是试了自己组的几个基因，他们发现NgAgo可能有很低的效率（只给了个估值，<5%
），用测序检测出来的； 相对应的CRISPR/Cas9对照，有20%的效率。缺少具体实验设
计，实验材料来源，实验方法等信息。
- 呼吁韩春雨发布效率更高的NgAgo的版本
- 声明会继续重复验证实验
编者注：
1.韩春雨NBT原文中，NgAgo和CRISPR/Cas9的效率很接近
2.截止到2016年9月2日，在这个发布信息一个多月以后，仇子龙组仍然没有发布任何相
关的追加实验结果信息
3.仇子龙组如果有后续试验结果，建议他们向“澳洲哥”学习
- “澳洲哥”虽然一开始给大家带来了一些不完全的，比较让人困惑的信息，后面认真
追加实验，并详细分析，公布实验细节，“open science... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 37 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 38 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 39 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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n*******3
发帖数: 128 | 40 1月5日，孟山都宣布与哈佛大学-麻省理工学院的Broad研究院就新型的CRISPR-Cpf1基
因组编辑技术在农业中的应用达成全球许可协议。新的CRISPR-Cpf1系统与CRISPR-Cas9
系统相比，在针对性的改善细胞DNA方面有望变得更加简单和精确，是基因编辑技术领
域的重大进展。
研究人员相信CRISPR-Cpf1系统相较于CRISPR-Cas9，在改善农业产品方面，能够带来
更多的好处，包括更加灵活的编辑方式以及编辑发生位点。此外，体积更小的CRISPR-
Cpf1系统使研究人员能够在多种作物中更加灵活的运用基因编辑技术。
“CRISPR-Cpf1系统是基因编辑领域最新的一个重大发现，我们很高兴能够获得该系统
的许可授权，并将其添加到我们快速发展的基因编辑工具库中。”孟山都的生物技术总
监Tom Adams博士说道，“这个新的系统带来了一个技术上的革新，能够通过多种方式
改善作物。同时研究人员也获得了更大的灵活性和新功能来通过基因编辑这个新兴技术
来改善农业。”
“CRISPR-Cpf1系统是基因编辑研究领域中一项革命性的应用成果。” Broad研究院的
首席商务官Issi... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 41 此技术前景如何？
科学家利用基因编辑技术剔除小鼠艾滋病病毒
新华社华盛顿4月10日电（记者 林小春）美国天普大学华人科学家胡文辉等人近日报告
说，他们利用基因编辑技术，有效剔除了一种人源化小鼠多个器官组织中的人类艾滋病
病毒，朝着开展人类临床试验的方向迈出一大步。
此前，胡文辉等人已成功利用基因编辑技术，有效清除了体外培养的人类细胞系、
艾滋病患者体内取出的T免疫细胞以及转基因小鼠体内的艾滋病病毒。
人源化BLT小鼠是指移植了人的骨髓、肝和胸腺组织或细胞的免疫缺陷小鼠。这种
小鼠具有人类功能性免疫系统，被艾滋病病毒感染和潜伏的方式与人类一致，克服了常
规小鼠不能复制某些人类疾病的弊端，被广泛用于艾滋病动物实验研究。
在发表于美国《分子治疗》杂志的最新研究中，胡文辉和同校同事卡迈勒·哈利利
以及匹兹堡大学杨文彬等人首先利用艾滋病病毒感染人源化BLT小鼠，然后借助腺相关
病毒（AAV）作为载体，把有“基因剪刀”之称的CRISPR/Cas9基因编辑工具运送到潜伏
感染小鼠体内。2到4周后，他们在多个小鼠器官组织中检测到艾滋病病毒基因组被切除。
胡文辉副教授告诉新华社记者，艾滋病病毒基因易于突... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 42 Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing
specificity
作者
F Ann Ran, Patrick D Hsu, Chie-Yu Lin, Jonathan S Gootenberg, Silvana
Konermann, Alexandro E Trevino, David A Scott, Azusa Inoue, Shogo Matoba, Yi
Zhang, Feng Zhang
重复出来的也可以说说，我到现在都高度怀疑有人拿Cas9 wild type的数据冒充Cas9n
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发帖数: 1 | 43 你总共鉴定了多少个单克隆才成功的？ 我知道的一个马普实验室鉴定了2000个才成功
一个，而且还是仅仅在使用野生型Cas9的情况下。我自己鉴定了1000多个，野生型的
Cas9，没有
成功。 文章中高达十分之一的成功率是怎么得来的。https://www.nature.com/nprot/
journal/v8/n11/full/nprot.2013.143.html
另外，据Google Group上面的讨论，FEI ANN RAN 在Addgene上面所提供的PX459质粒居
然混有带有SNP的变种质粒，实验室的管理方面应该存在问题。 |
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发帖数: 1 | 44 河北科技大學副教授韓春雨，今被《自然-生物技述》撤稿，引發造假質疑。取自澎湃
新聞
韓春雨發表的NgAgo-gDNA技術，號稱能媲美已有「基因魔剪」之稱的CRISPR-Cas9，對
基因的特定位點進行準確地剔除、添入等，被譽有諾獎級別。取自鳳凰網
去年5月在國際頂級科學期刊《自然·生物技術》發表新基因編輯技朮NgAgo-gDNA論文
，被譽離再獲諾獎已近在咫尺的河北科技大學副教授韓春雨，今（3）日被《自然-生物
技術》撤稿，並以社論評價「雖然許多國際實驗室都進行了努力，但沒有獨立重覆的驗
證」，一句話間接證實韓春雨可能造假，引發國際學研界軒然大波。
《自然-生物技術》期刊同時也發布了韓春雨團隊的撤稿聲明。韓春雨表示是主動申請
撤回。隨後，韓春雨也發表聲明，同意接受河北科技大學安排選擇一家第三方實驗室，
在同行專家支持下開展實驗，驗證NgAgo-gDNA基因編輯的有效性，並將實驗結果公布，
以回應社會關切。
韓春雨撤稿，非但沒有止住風波，反而引起更大的質疑聲浪。由於韓春雨在《自然-生
物技術》期刊從默默無聞，一夕聲名鵲起後，獲得人民幣兩億科研經費、也得了科協副
主席頭銜，無盡的風光。但在... 阅读全帖 |
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h*****t
发帖数: 64 | 45 刚刚拿了个R21，招个senior research associate.
The Center of Emphasis in Infectious Diseases at the Texas Tech University
Health Sciences Center El Paso in Texas is seeking a highly motivated
candidate for a Senior Research Associate position. The candidate will
participate in: 1. Perform genome-wide knockout screening to study various
biology processes using a CRISPR-Cas9 system-based strategy developed in our
lab (Cell Rep 2015,12(4):673-83). 2. Optimizing CRISPR-Cas9 system (Genome
Biology 2015, 16:28... 阅读全帖 |
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l******0
发帖数: 150 | 46 在微生物面前，人类还是一个自以为是的小孩子！
细菌在几十亿年之前就已经在地球上面生存，几十亿年的进化让细菌在地球上大获成功
，如今，细菌无处不在，空气、水、土壤、动植物身上都有细菌的身影！
细菌在地球上持续攻占了山川河流、植物、低等生物、甚至恐龙、哺乳动物，最后攻占
了人类的肚子！
是的，人类从出生那一刻开始就注定和细菌携手一辈子！（见本公众号原创文章Nature
！胎儿到底有没有细菌？）
别以为人类了不起，若是没有细菌在你肚子里面玩耍，你要想愉快地生活那是绝对不可
能的！如今的微生物研究可以揭示一定的道理：你需要伺候好你肚子里面的细菌，否则
它们要是闹腾起来，你的整个身体运转恐怕会出问题！
▲艺术家设计的一种模拟细菌培养皿中绘画艺术（图片来自网络）
看到这里，是不是以为颠覆了你的想象？这是一个细菌统治的世界！
▶噬菌体的进攻◀
然而，好就好在这个地球有一个所有的物种都逃不过的自然规律，那就是：相生相杀！
这正是我们中国的古话说的：一物降一物。
这正是生态平衡的概念！自然界的一切都是维持生态平衡，你细菌若是强大到无人能敌
，强大到肆掠地球，无法无天，那还得了？因... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 47 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 48 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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c***s
发帖数: 70028 | 49 方舟子公开发文质疑河北科技大学韩春雨“诺贝尔奖级”实验成果存在“不可重复复制操作”的问题，暗指韩春雨科研成果的真实性，并批评韩春雨对质疑的回应态度。
今年5月2日，《自然》系列顶级刊物《Nature Biotechnology》(中文名《自然生物技术》)在线发表了来自中国河北科技大学生物科学与工程学院青年教师韩春雨副教授题为《DNA- guided genome editing using the Natronobacteriumgregoryi Argonaute》的重大原创性成果。韩春雨的团队发明了一种新的基因编辑技术NgAgo-gDNA，向已有的最时兴技术CRISPR-CAS9发起了挑战。后者被认为是第三代基因编辑技术，近些年来一直是诺贝尔奖的热门。
但方舟子在文中表示，韩春雨在公开场合的言论与他在论文里的描述存在诸多矛盾，方舟子称，“韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调，他目前的NgAgo是初级版、需要高超的实验技巧”，而方舟子认为韩春雨描述的只是并不复杂的转染实验，是现成的技术，并不需要高超的实验技巧，按照其提供的步骤应该是不难被重复出来的才对，而不应该出现“没法重复该实验”的... 阅读全帖 |
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a***s
发帖数: 12296 | 50 由于多位科学家称未能重复实验结果，曾在国际期刊发表论文的河北科技大学副教授韩春雨受到质疑。昨日，他告诉记者，并不会回复这些质疑，并认为质疑“不科学”，实验结果的讨论还得回归科学本身。
韩春雨被称为“三无”副教授：无名校（非985非211的河北科技大学）身份、无名气（名不见经传，几乎没有任何人才头衔称号）、无职位（无行政职位），他的实验室也简陋得令人惊讶。
实验结果无法重复遭质疑
由于实验结果无法重复，韩春雨发表在世界顶级期刊的实验结果遭受质疑。此前曾称已重复实验成功的澳大利亚国立大学医学、生物和环境学院教授盖坦·巴尔焦发表博客称，经过多次尝试，仍未重复出韩春雨的结果。
据了解，2016年5月2日，韩春雨课题组的论文《DNA-guided genome editing using the NatronobacteriumgregoryiArgonaute》在《自然-生物技术》杂志在线发表。论文内容大致为，以DNA来介导NgAgo（一种核酸内切酶）对靶向基因的识别从而进行基因编辑，被认为是基因编辑领域的重大突破。
博客中，巴尔焦说，他仍未发现任何证据证明NgAgo能进行基因组编辑。他甚至得... 阅读全帖 |
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