m*********D 发帖数: 1727 | 1 (这个问题本来是放在另一网友的回帖里的,没有人注意或回答,就再拉出来示众。)
转化(transfection)效率低的话,cell sorting或Puro selection不是可以解决吗?
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个是siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题(不能超过十天左右),也就是transfection后不能等太长。而
CRISPR/cas9是permanent genome editing,没有时间问题;同时又不能保证
transfected cells一定有genome editing发生,这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章,一个library是针对18000个基因,另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal transduction cascade。老板说主意不错(当然布
什我自己的主意),可得有钱啊。不知道这两个library是不是可以买或者借来用。不
过,这library不用自己建吧。
恕我愚钝。谢谢指教! |
j******i 发帖数: 939 | 2 干细胞,体内等,都需要virus才能高效进去。对于cas9的应用,virus可以控制MOI,
transfection一转就是一坨。估计大家一看这个问题,就在纳闷是哪个新phd学生在提
问。。。 |
m*********D 发帖数: 1727 | 3 嘿嘿,cas9对我就是生物对新Ph.D.么。:)。
对需要transfection效率需要高的体系,你说的体内可以理解。对少数细胞系因
transfection效率低,不是可以筛选吗?
“一转就是一坨”是只转进去的DNA太多,怕off-target? |
m********2 发帖数: 317 | 4 有一些细胞在体外不能培养超过五天,有一些细胞对抗性筛选很敏感。 |
j******i 发帖数: 939 | 5 即使可以筛选也是效率越高越好是不?DNA太多当然有off-target的问题,还有一些特殊
的应用,比如screen的时候,就会希望一个细胞只有一种gRNA。
【在 m*********D 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 嘿嘿,cas9对我就是生物对新Ph.D.么。:)。 : 对需要transfection效率需要高的体系,你说的体内可以理解。对少数细胞系因 : transfection效率低,不是可以筛选吗? : “一转就是一坨”是只转进去的DNA太多,怕off-target?
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m*********D 发帖数: 1727 | 6 谢谢!这种情况还没有碰到过,开眼界。
【在 m********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有一些细胞在体外不能培养超过五天,有一些细胞对抗性筛选很敏感。
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m*********D 发帖数: 1727 | 7 你说的screen和我说的library是同一回事,理解。谢谢!
特殊
【在 j******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 即使可以筛选也是效率越高越好是不?DNA太多当然有off-target的问题,还有一些特殊 : 的应用,比如screen的时候,就会希望一个细胞只有一种gRNA。
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n***y 发帖数: 114 | 8 High transducing efficiency, 楼上Jessecai正解,作genome wide screening 的时
候,MOI要小,希望每个细胞一个sgRNA。就是你不希望有的sgRNA因为转染效率而错过吧
没人看Feng Zhang的workshop吗
也请教中西博后提出的第二个问题。 |
m*********D 发帖数: 1727 | 9 你是问那个library的availability吧?我也感兴趣。
我倒是觉得genome screening不是大问题。如果一个细胞里进去3-5个guide seq.,三
五个基因knockout,外加off-target,一deep seq,基本就知道了对象。这个思维在没有
好的合适自动化的high-throughput screening的时候,一个样品里加十个compounds,
有了效应在一个一个分析差不多。倒是用这样的library,细胞的转化效率确实要考虑。
不用virus delivery,效率低,会比较麻烦。
mousemice网友说的有些细胞对筛选敏感我自己体会过。我用的deliver方式是有25-50%
的细胞能被transfected。但我筛选后只有大约1%细胞survive。以前和这里一个网友交
流时,他/她用sorting,也是1%。我想很多transfected细胞也许表达量不足,过不料
筛选这关。不知道cas9的表达量和genome edit的效应的平衡点如何,太多会有太多off
-target,太少连自己的target也切不了。估计也是不同细胞不一样。
我还顺便问个有关off-target的问题:目前看到的都是找几个最可能的off-targets来
证明没有off-target,没有整个genome sequencing的。对于off-target的质疑,可不可
以用多个clone来回答?这就和stable cell line有关integration site的疑问一样,
不同的细胞line的integration site不一样,如果效应一样就可以了。我作的mutation
,有多个克隆,也在考虑是完全seq呢,还是看几个不同克隆的表性,如果一直就可以了。
过吧
【在 n***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : High transducing efficiency, 楼上Jessecai正解,作genome wide screening 的时 : 候,MOI要小,希望每个细胞一个sgRNA。就是你不希望有的sgRNA因为转染效率而错过吧 : 没人看Feng Zhang的workshop吗 : 也请教中西博后提出的第二个问题。
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n***y 发帖数: 114 | |
l***y 发帖数: 638 | 11 keith joung就是个灌水王,他lab灌出来的东西先等一阵看用的人多不多再评价
【在 n***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 现在off-target已经有几种方法可以检测,其中一种http://phys.org/news/2014-12-method-genome-wide-off-target-cleavage-sites.html
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m*********D 发帖数: 1727 | 12 谢谢两位的信息!大概看了一下,还不那么容易。我可能还是走多克隆的路线。我手中
每个mutation都有三四个克隆,看能不能过关。
commercially available library找到了。网上地址是:
http://www.cellecta.com/technology-portfolio/crispr-cas9-for-ge |