m*********D
发帖数: 1727 | 1 （这个问题本来是放在另一网友的回帖里的，没有人注意或回答，就再拉出来示众。）
转化（transfection)效率低的话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个是siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题（不能超过十天左右），也就是transfection后不能等太长。而
CRISPR/cas9是permanent genome editing，没有时间问题；同时又不能保证
transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal transduction cascade。老板说主意不错（当然布
什我自己的主意），可得有钱啊。不知道这两个library是不是可以买或者借来用。不
过，这library不用自己建吧。
恕我愚钝。谢谢指教！ |
j******i
发帖数: 939 | 2 干细胞，体内等，都需要virus才能高效进去。对于cas9的应用，virus可以控制MOI,
transfection一转就是一坨。估计大家一看这个问题，就在纳闷是哪个新phd学生在提
问。。。 |
m*********D
发帖数: 1727 | 3 嘿嘿，cas9对我就是生物对新Ph.D.么。：）。
对需要transfection效率需要高的体系，你说的体内可以理解。对少数细胞系因
transfection效率低，不是可以筛选吗？
“一转就是一坨”是只转进去的DNA太多，怕off-target? |
m********2
发帖数: 317 | 4 有一些细胞在体外不能培养超过五天，有一些细胞对抗性筛选很敏感。 |
j******i
发帖数: 939 | 5 即使可以筛选也是效率越高越好是不？DNA太多当然有off-target的问题，还有一些特殊
的应用，比如screen的时候，就会希望一个细胞只有一种gRNA。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 嘿嘿，cas9对我就是生物对新Ph.D.么。：）。
: 对需要transfection效率需要高的体系，你说的体内可以理解。对少数细胞系因
: transfection效率低，不是可以筛选吗？
: “一转就是一坨”是只转进去的DNA太多，怕off-target?
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m*********D
发帖数: 1727 | 6 谢谢！这种情况还没有碰到过，开眼界。
【在 m********2 的大作中提到】
: 有一些细胞在体外不能培养超过五天，有一些细胞对抗性筛选很敏感。
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m*********D
发帖数: 1727 | 7 你说的screen和我说的library是同一回事，理解。谢谢！
特殊
【在 j******i 的大作中提到】
: 即使可以筛选也是效率越高越好是不？DNA太多当然有off-target的问题，还有一些特殊
: 的应用，比如screen的时候，就会希望一个细胞只有一种gRNA。
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n***y
发帖数: 114 | 8 High transducing efficiency, 楼上Jessecai正解，作genome wide screening 的时
候，MOI要小，希望每个细胞一个sgRNA。就是你不希望有的sgRNA因为转染效率而错过吧
没人看Feng Zhang的workshop吗
也请教中西博后提出的第二个问题。 |
m*********D
发帖数: 1727 | 9 你是问那个library的availability吧？我也感兴趣。
我倒是觉得genome screening不是大问题。如果一个细胞里进去3-5个guide seq.，三
五个基因knockout,外加off-target,一deep seq,基本就知道了对象。这个思维在没有
好的合适自动化的high-throughput screening的时候，一个样品里加十个compounds,
有了效应在一个一个分析差不多。倒是用这样的library,细胞的转化效率确实要考虑。
不用virus delivery,效率低，会比较麻烦。
mousemice网友说的有些细胞对筛选敏感我自己体会过。我用的deliver方式是有25-50%
的细胞能被transfected。但我筛选后只有大约1%细胞survive。以前和这里一个网友交
流时，他/她用sorting，也是1%。我想很多transfected细胞也许表达量不足，过不料
筛选这关。不知道cas9的表达量和genome edit的效应的平衡点如何，太多会有太多off
-target,太少连自己的target也切不了。估计也是不同细胞不一样。
我还顺便问个有关off-target的问题：目前看到的都是找几个最可能的off-targets来
证明没有off-target,没有整个genome sequencing的。对于off-target的质疑，可不可
以用多个clone来回答？这就和stable cell line有关integration site的疑问一样，
不同的细胞line的integration site不一样，如果效应一样就可以了。我作的mutation
,有多个克隆，也在考虑是完全seq呢，还是看几个不同克隆的表性，如果一直就可以了。
过吧
【在 n***y 的大作中提到】
: High transducing efficiency, 楼上Jessecai正解，作genome wide screening 的时
: 候，MOI要小，希望每个细胞一个sgRNA。就是你不希望有的sgRNA因为转染效率而错过吧
: 没人看Feng Zhang的workshop吗
: 也请教中西博后提出的第二个问题。
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n***y
发帖数: 114 | |
l***y
发帖数: 638 | 11 keith joung就是个灌水王，他lab灌出来的东西先等一阵看用的人多不多再评价
【在 n***y 的大作中提到】
: 现在off-target已经有几种方法可以检测，其中一种http://phys.org/news/2014-12-method-genome-wide-off-target-cleavage-sites.html
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m*********D
发帖数: 1727 | 12 谢谢两位的信息！大概看了一下，还不那么容易。我可能还是走多克隆的路线。我手中
每个mutation都有三四个克隆，看能不能过关。
commercially available library找到了。网上地址是：
http://www.cellecta.com/technology-portfolio/crispr-cas9-for-ge |
