m********2
发帖数: 317 | 1 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
有同学用过这篇文章提到过的质粒吗?
我用了，但是不workwork，包病毒的时候能看到293T细胞全部绿了，但是收集的病毒
titer非常非常低，根本不能重复文章中的转染效率。 |
z*t
发帖数: 863 | 2 It's a headache for us too... I have to say some of their transduction
efficacy is too good...
I wonder if people also used Feng Zhang's Gecko lenti plasimid before? Since
Cas9 is big, it's hard to get good titer of virus...if the titer of
lentivirus with Cas9 is low, then I think it's Cas9's problem..
genetic
【在 m********2 的大作中提到】
: Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
: 22.
: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
: lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
: 有同学用过这篇文章提到过的质粒吗?
: 我用了，但是不workwork，包病毒的时候能看到293T细胞全部绿了，但是收集的病毒
: titer非常非常低，根本不能重复文章中的转染效率。
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d****u
发帖数: 1553 | 3 张峰实验室的V1 plentiCRISPR感染效率不算高，毒性很大；加多了细胞尤其是primary
cell死得很厉害。V2 vector他们号称感染效率高很多倍，但是实际用的时候并没有那
么明显，但是毒性明显下来了。 |
z*t
发帖数: 863 | 4 那看来还是包病毒的问题
上次derrick rossi 来做报告讲到他那篇cell stem cell也说他们用了质粒而不是病毒
primary
【在 d****u 的大作中提到】
: 张峰实验室的V1 plentiCRISPR感染效率不算高，毒性很大；加多了细胞尤其是primary
: cell死得很厉害。V2 vector他们号称感染效率高很多倍，但是实际用的时候并没有那
: 么明显，但是毒性明显下来了。
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m********2
发帖数: 317 | 5 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
for the original virus we have been using standard calcium phosphate
transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
vector:psPAX2:pMD2.G.
The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
concentrated 50-100x with ultrazentrifugation at approx 100k x g for 2h.
Infektion of LSK or cKit+ cells was performed by plating the cells on
Retronectin coated plates followed by direct infection with MOI of approx 50
(Titer determined on HEL cells). For LSK culture Scf/thpo (50ng/ml each)
starting 48h prior to infection works well with balanced proliferation and
maintained stemness.
Unfortunately production of virus is highly dependent on local factors like
the actual batch of 293T cells, supplier of medium and supplements, FBS and
potentially many more factors.
We did spend quite some time till it was optimized and from my own
experience I can unfortunately tell you that producing virus with 1kb insert
size or 5.5kb insert size are completely different things.
This also means that there was no miracle to the protocols we used to
generate the virus but optimization of the most influential factors was
needed.
我还要继续追着刨根问底吗? |
z*t
发帖数: 863 | 6 我觉得是系统性问题...基本和我们的经验一致
genetic
【在 m********2 的大作中提到】
: Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
: 22.
: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
: lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
: 给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
: for the original virus we have been using standard calcium phosphate
: transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
: vector:psPAX2:pMD2.G.
: The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
: concentrated 50-100x with ultrazentrifugation at approx 100k x g for 2h.
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m********2
发帖数: 317 | 7 那他们文章上面显示的转染效率很高啊，达到40％.
那个第一作者说，现在他们的转染效率也很稳定在20％左右，为什么我从来没有达到过
，我也做了几年慢病毒了
【在 z*t 的大作中提到】
: 我觉得是系统性问题...基本和我们的经验一致
:
: genetic
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m********2
发帖数: 317 | 8 我觉得这种回答是非常不负责任的方式，当然也是非常常用的。
既然文章里的转染效率那么好，其他人也应该能做出来，如果有什么窍门，应该把
protocol写出来，到底用的什么293细胞，什么牌子的PBS，catalog number等等都列出
来，现在nature系列杂志不是都要求列出catalog number吗。
Unfortunately production of virus is highly dependent on local factors like
the actual batch of 293T cells, supplier of medium and supplements, FBS and
potentially many more factors.
We did spend quite some time till it was optimized and from my own
experience I can unfortunately tell you that producing virus with 1kb insert
size or 5.5kb insert size are completely different things.
This also means that there was no miracle to the protocols we used to
generate the virus but optimization of the most influential factors was
needed. |
j******i
发帖数: 939 | 9 生物里边有一种造假就是数据夸大，提高20%说成90%，2倍说成10倍。你还不好证实他
造假，毕竟是有提高的。 |
j******i
发帖数: 939 | 10 如果楼主能顺利包出一个普通的lenti gfp的话，那以下这句话是不成立的－
Unfortunately production of virus is highly dependent on local factors like
the actual batch of 293T cells, supplier of medium and supplements, FBS and
potentially many more factors. |
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z*t
发帖数: 863 | 11 他们好像是Ko 了某个gene?或者select了好的data show出来
我的经验是一般没有advantage 的话HSC transduction在20%左右
【在 m********2 的大作中提到】
: 那他们文章上面显示的转染效率很高啊，达到40％.
: 那个第一作者说，现在他们的转染效率也很稳定在20％左右，为什么我从来没有达到过
: ，我也做了几年慢病毒了
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m********2
发帖数: 317 | 12 我在用他们的质粒的同时一直有一个阳性对照，也是lenti backbone，阳性对照工作非
常好。
看看通讯作者，还挺厉害的，算是个rising star，说不定以后还要审我的文章呢，忍了
like
and
【在 j******i 的大作中提到】
: 如果楼主能顺利包出一个普通的lenti gfp的话，那以下这句话是不成立的－
: Unfortunately production of virus is highly dependent on local factors like
: the actual batch of 293T cells, supplier of medium and supplements, FBS and
: potentially many more factors.
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m********2
发帖数: 317 | |
m********2
发帖数: 317 | 14 问题是我用他的质粒，用了不同的方法转染HSC，根本就没有成功。
转染一些细胞系倒是能看到绿色细胞。
【在 z*t 的大作中提到】
: 他们好像是Ko 了某个gene?或者select了好的data show出来
: 我的经验是一般没有advantage 的话HSC transduction在20%左右
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j******i
发帖数: 939 | 15 有用Retronectin吗？有Retronectin的话，用普通的gfp virus转20-40%还是很容易的。
【在 m********2 的大作中提到】
: 问题是我用他的质粒，用了不同的方法转染HSC，根本就没有成功。
: 转染一些细胞系倒是能看到绿色细胞。
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m********2
发帖数: 317 | 16 我们自己修饰了一个慢病毒载体，不用retronectin，也不用polybrene，转染
HSC轻轻松松能达到60％.
他的那个载体我浓缩了500倍，用了retronectin，根本没有GFP阳性细胞
的。
【在 j******i 的大作中提到】
: 有用Retronectin吗？有Retronectin的话，用普通的gfp virus转20-40%还是很容易的。
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j******i
发帖数: 939 | 17 😓
【在 m********2 的大作中提到】
: 我们自己修饰了一个慢病毒载体，不用retronectin，也不用polybrene，转染
: HSC轻轻松松能达到60％.
: 他的那个载体我浓缩了500倍，用了retronectin，根本没有GFP阳性细胞
:
: 的。
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z****u
发帖数: 1007 | 18 借问一下有人使用过 R26-CMV-CAS9 老鼠 JAX 024858 做过比如knockin 或者knockout
老鼠不。感觉好用不。 |
m********2
发帖数: 317 | 19 是个好工具，但是如果想用人的细胞就还需要cas9病毒了
这个小鼠也有个问题就是，不知道CAG promoter是不是universe表达的
knockout
【在 z****u 的大作中提到】
: 借问一下有人使用过 R26-CMV-CAS9 老鼠 JAX 024858 做过比如knockin 或者knockout
: 老鼠不。感觉好用不。
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z*t
发帖数: 863 | 20 我觉得是系统性问题...基本和我们的经验一致
genetic
【在 m********2 的大作中提到】
: Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
: 22.
: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
: lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
: 给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
: for the original virus we have been using standard calcium phosphate
: transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
: vector:psPAX2:pMD2.G.
: The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
: concentrated 50-100x with ultrazentrifugation at approx 100k x g for 2h.
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z*t
发帖数: 863 | 21 我觉得是系统性问题...基本和我们的经验一致
genetic
【在 m********2 的大作中提到】
: Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
: 22.
: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
: lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
: 给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
: for the original virus we have been using standard calcium phosphate
: transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
: vector:psPAX2:pMD2.G.
: The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
: concentrated 50-100x with ultrazentrifugation at approx 100k x g for 2h.
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j******i
发帖数: 939 | 22 系统性问题是什么意思？
【在 z*t 的大作中提到】
: 我觉得是系统性问题...基本和我们的经验一致
:
: genetic
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