C****n
发帖数: 79 | 1 先感谢版上的各位大虾，经过trouble-shooting，CRISPR在我们这个真菌里总算work了
。不过现在有个现象我解释不清楚，由于本人遗传学不是很强，所以想再次请教一下专
家。
我拿到单mutant后，sequence了target，但是很奇怪，sequencing结果显示我们这个
diploid的真菌只有一个单一的mutated target，这是为什么呢？NHEJ是随机的，理论
上说， diploid应该会出现两个allel不同的情况。是发生了gene conversion了，还是
其他原因？谢谢 |
r***e
发帖数: 2539 | 2 运气好，两个allel都改了。
【在 C****n 的大作中提到】
: 先感谢版上的各位大虾，经过trouble-shooting，CRISPR在我们这个真菌里总算work了
: 。不过现在有个现象我解释不清楚，由于本人遗传学不是很强，所以想再次请教一下专
: 家。
: 我拿到单mutant后，sequence了target，但是很奇怪，sequencing结果显示我们这个
: diploid的真菌只有一个单一的mutated target，这是为什么呢？NHEJ是随机的，理论
: 上说， diploid应该会出现两个allel不同的情况。是发生了gene conversion了，还是
: 其他原因？谢谢
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w***a
发帖数: 4361 | 3 偶也有介个问题，genomic PCR以后测了20个克隆，全部是一摸一样的突变。
估计NHEJ修复的时候，某些错误出现的频率很高吧，
所以也不见得就是完全随机的mutation。也许跟guide sequence target的位置有关。
【在 C****n 的大作中提到】
: 先感谢版上的各位大虾，经过trouble-shooting，CRISPR在我们这个真菌里总算work了
: 。不过现在有个现象我解释不清楚，由于本人遗传学不是很强，所以想再次请教一下专
: 家。
: 我拿到单mutant后，sequence了target，但是很奇怪，sequencing结果显示我们这个
: diploid的真菌只有一个单一的mutated target，这是为什么呢？NHEJ是随机的，理论
: 上说， diploid应该会出现两个allel不同的情况。是发生了gene conversion了，还是
: 其他原因？谢谢
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j****n
发帖数: 3370 | 4 也有可能是同源重组了
之前做polyploid 如果没有全部敲除 没有筛选压力的话 又全部变回widtype了
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1
【在 w***a 的大作中提到】
: 偶也有介个问题，genomic PCR以后测了20个克隆，全部是一摸一样的突变。
: 估计NHEJ修复的时候，某些错误出现的频率很高吧，
: 所以也不见得就是完全随机的mutation。也许跟guide sequence target的位置有关。
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C****n
发帖数: 79 | 5 两个allel都改了倒是不错，但是都改成一样的。另外我没有加入donor DNA，这就很奇
怪。
【在 r***e 的大作中提到】
: 运气好，两个allel都改了。
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C****n
发帖数: 79 | 6 你说的这个就是gene conversion吧.
【在 j****n 的大作中提到】
: 也有可能是同源重组了
: 之前做polyploid 如果没有全部敲除 没有筛选压力的话 又全部变回widtype了
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1
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C****n
发帖数: 79 | 7 我随机挑取了5个单clone， 提gDNA， PCR然后测序，这五个mutants之间的序列是不同
，但是对于每一个clone，只有一个测序结果，也就是说两个allel都突变成一样的序列
，这就很奇怪。
【在 w***a 的大作中提到】
: 偶也有介个问题，genomic PCR以后测了20个克隆，全部是一摸一样的突变。
: 估计NHEJ修复的时候，某些错误出现的频率很高吧，
: 所以也不见得就是完全随机的mutation。也许跟guide sequence target的位置有关。
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j****n
发帖数: 3370 | 8 和你描述的有啥区别？只是一个convert to wildtype 你的是convert成另一个allele
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2
【在 C****n 的大作中提到】
: 你说的这个就是gene conversion吧.
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w***a
发帖数: 4361 | 9 我的也是这种情况，puromycin筛选以后，随机挑了6个clone，
结果5个是wildtype，只有一个是突变。
这个突变克隆，测了20个genomic PCR product，发现全部是同一个突变。
当时偶也觉得蛮奇怪的，后来western做完，目标蛋白确实没了，就不管了这事了。。。
【在 C****n 的大作中提到】
: 我随机挑取了5个单clone， 提gDNA， PCR然后测序，这五个mutants之间的序列是不同
: ，但是对于每一个clone，只有一个测序结果，也就是说两个allel都突变成一样的序列
: ，这就很奇怪。
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w***a
发帖数: 4361 | 10 会不会挑细胞的时候，挑的不是单克隆？
如果混入wildtype细胞，没有筛选压力，时间长了knockout细胞肯定被稀释没了撒。
【在 j****n 的大作中提到】
: 也有可能是同源重组了
: 之前做polyploid 如果没有全部敲除 没有筛选压力的话 又全部变回widtype了
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1
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j****n
发帖数: 3370 | 11 做了这么多年 还不至于吧
挑了好多的克隆 都是这个样子
尤其是某些yeast 同源重组的效率很高 可以想象 这种情况的同源臂无限长。。。
【在 w***a 的大作中提到】
: 会不会挑细胞的时候，挑的不是单克隆？
: 如果混入wildtype细胞，没有筛选压力，时间长了knockout细胞肯定被稀释没了撒。
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n***y
发帖数: 114 | 12 一个allele利用另一个allele作为修复的模板，两个alleles切割和修复不是同时发生
的，一前一后
。可以参考我以前发的帖子，MCR。 |
