L****e
发帖数: 499 | 1 我现在要研究一种蛋白质的酶活性，这个蛋白家族的另外一个同源蛋白有一种水解酶活
性，我现在想要研究我这种蛋白是否也有这种酶活性。开始我是直接用转染了蛋白的细
胞 homogenate 加上底物体外反应后做质谱，检测到水解产物，但是因为cell
homogenate 里有太多的各种蛋白了，所以结果没有直接的说服力。现在我想用his tag
来纯化我这种蛋白。
我的问题是我在裂解转染的细胞的时候肯定是不能加蛋白酶抑制剂的，否则纯化的蛋白
就没有活性了，可是纯化有这么多的步骤，经过很长的时间，我如何保证我的蛋白在纯
化过程中不被细胞中的各种蛋白酶降解呢。另外，我用His60 Ni resin 来纯化蛋白，
这个beads 是在ethanol 里，有没有必要在将bead加到细胞裂解液中之前洗掉bead中的
ethanol? washing buffer 中的imidazol 对蛋白活性有影响吗？
还请有蛋白纯化经验的前辈指教一二。多谢了 |
x****6
发帖数: 4339 | 2 你肯定要过表达你的目标蛋白的。如果这个蛋白对细胞没有太大毒性的话，一般过表达
蛋白能达到总蛋白的>>10%。有这么多目标蛋白，蛋白酶也分解不完。而且从你裂解细
胞到过柱，时间并不是很长。
所以实验的关键是如何实现足够大的表达量。有很多策略可以使用的。 |
l**********0
发帖数: 216 | 3 问题太初级，beads先用loading buffer （一般tris， pH 8， 加150 到500 mM 氯化
钠，如果目标蛋白有free的Cys加10 mM b-Me，如果需要加detergent，还可以适当加20
mM imidazole）处理，去掉ethanol，再mix and bind your protein, then elute |
W*******n
发帖数: 4140 | 4 你刚入门吧。被扔了好些年的科研，我还记得一点点。我觉得，你总得走个胶吧。生物
实验室奴工常搖瓶，常养耗子，常走胶。要准确一点，判断你要的蛋白质没怎么降解，
还有别的耍法，如搞个质谱。 |
c****c
发帖数: 36 | 5 你那个蛋白有没有selective的inhibitor，如果有，加到lysate里试试看
要不然RNAi knockdown看活性有没有降低
纯化的蛋白就是有一点，你in vitro的量不一定真正代表endogenous level，所以in
vitro work了以后你还是要knockdown或者knock out了再测 |
i***l
发帖数: 1656 | 6 问题们都太初级， 坑？？
tag
【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一种蛋白质的酶活性，这个蛋白家族的另外一个同源蛋白有一种水解酶活
: 性，我现在想要研究我这种蛋白是否也有这种酶活性。开始我是直接用转染了蛋白的细
: 胞 homogenate 加上底物体外反应后做质谱，检测到水解产物，但是因为cell
: homogenate 里有太多的各种蛋白了，所以结果没有直接的说服力。现在我想用his tag
: 来纯化我这种蛋白。
: 我的问题是我在裂解转染的细胞的时候肯定是不能加蛋白酶抑制剂的，否则纯化的蛋白
: 就没有活性了，可是纯化有这么多的步骤，经过很长的时间，我如何保证我的蛋白在纯
: 化过程中不被细胞中的各种蛋白酶降解呢。另外，我用His60 Ni resin 来纯化蛋白，
: 这个beads 是在ethanol 里，有没有必要在将bead加到细胞裂解液中之前洗掉bead中的
: ethanol? washing buffer 中的imidazol 对蛋白活性有影响吗？
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l***y
发帖数: 4671 | 7 如果是serine hydrolase 可以试试 ActivX 的这个 probe：
http://www.activxprobes.com/probes/serine_hydrolase.html
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【在 L****e 的大作中提到】
: 我现在要研究一种蛋白质的酶活性，这个蛋白家族的另外一个同源蛋白有一种水解酶活
: 性，我现在想要研究我这种蛋白是否也有这种酶活性。开始我是直接用转染了蛋白的细
: 胞 homogenate 加上底物体外反应后做质谱，检测到水解产物，但是因为cell
: homogenate 里有太多的各种蛋白了，所以结果没有直接的说服力。现在我想用his tag
: 来纯化我这种蛋白。
: 我的问题是我在裂解转染的细胞的时候肯定是不能加蛋白酶抑制剂的，否则纯化的蛋白
: 就没有活性了，可是纯化有这么多的步骤，经过很长的时间，我如何保证我的蛋白在纯
: 化过程中不被细胞中的各种蛋白酶降解呢。另外，我用His60 Ni resin 来纯化蛋白，
: 这个beads 是在ethanol 里，有没有必要在将bead加到细胞裂解液中之前洗掉bead中的
: ethanol? washing buffer 中的imidazol 对蛋白活性有影响吗？
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L****e
发帖数: 499 | 8 多谢各位大牛的指教，特别是王状元博士的建议简直是醍醐灌顶啊。啥都不说了，跑质
谱去了 |
