m*********D
发帖数: 1727 | 1 请教行家：Feng Zhang的genome-wide Screening（CRISPR)后面的deep sequencing
对这个很感兴趣。读了几篇相关的文章和screening,前面的library--infection--drug
screening--genomic DNA extraction都懂。后面的deep sequencing部分就糊涂了。
理论上讲，resistant的细胞一定是有基因改变了的，我一直以为挑单克隆，一个一个
去作整个genome测序。仔细读了文章，是药物筛选几天后，细胞pool一起，再作deep
sequence；对照没有drug筛选（Non-resistant)的组，找出那些被CRISPR改变了的gene
，再确认。
几个问题：
1。这个deep sequencing是测（整个）genomic DNA，还是测留下来的guide sequence
（在lentiviral vector上面）？
2。可以测mRNA/cDNA序列来代替genomic DNA吗？突变的基因总该表现在mRNA上（先不
考虑其他类型的RNA）。
3。因为是pool一起的，不是单个克隆，这个sequencing出来的大量数据比较肯定是
bioinformatics方面的工作。这个有公司作没有？
谢谢！ |
O**********a
发帖数: 317 | 2 测guide RNA，因为整合到genome上了。用通用引物扩增，测里面的gRNA序列。比测
mRNA好。
数据分析很简单，因为序列都是知道的，看哪些序列被富集，就是tatget seq 。要的
通量很小的 |
m*********D
发帖数: 1727 | 3 大谢！
不记得lentivirus的vector会整合到genome呀。他那个GeCKO v2 vector（包含guide
sequence和Cas9)也能整合进genome吗？
我们有一个自己筛出来的compound，还有一个新的pathway, 所以，想借他的这个思路
，找出这个pathway上的其他蛋白分子。这个思路很不错。
谢谢这里的大侠们。上次来问CRISPR技术,倒是真用这里大侠们提供的方法和思路，作
出了single amino acid的突变（还有几个Nt的突变，引入酶切位点和搞掉PAM，但不改
变amino acid)，连两个拷贝都replace的克隆也拿到很多。这里还真酸生物同行的家。
：）。
【在 O**********a 的大作中提到】
: 测guide RNA，因为整合到genome上了。用通用引物扩增，测里面的gRNA序列。比测
: mRNA好。
: 数据分析很简单，因为序列都是知道的，看哪些序列被富集，就是tatget seq 。要的
: 通量很小的
|
O**********a
发帖数: 317 | 4 会整合。GeCKO不是puro筛了几天，再等几天吗
就是让gRNA整合并发挥作用。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：大谢！
：
：........... |
O**********a
发帖数: 317 | 5 v2有两种，一种是cas9和gRNA分开的，先建stable cell line表达cas9，再用lenti-
gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：大谢！
：
：........... |
m*********D
发帖数: 1727 | 6 他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天。
要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
你说的先作Cas9的stable我要考虑一下。就是作stable cell line太花时间。Cas9的表
达silence问题该不大。一般stable在我手里是三个月之后才出现基因表达走下坡。
Lentivirus感染效率高的话，一个vector省很多事啊。上次作点突变，我用普通的
lipofectamine 3000作transfection, 效率太差，少于10%的细胞能在三天的puromycin
selection后活下来。也许我用的puromycin量太高，2.5ug/ml。当时作了一个三天的
killing，找到能三天杀完host cell的最低量，就用上了。
再向你请教一下：vector整合进genome后，拿到genomic DNA，再用primers来扩增整合
的guide Sequences。这对PCR primers 就是直接从vector来的吗？我想象这对primers
正好在guide sequence的两边，无论vector整合到genome的什么地方，都能把guide
sequence扩增出来。Feng Zhang的文章里把PCR的primers都列了出来。
十分感谢！
【在 O**********a 的大作中提到】
: v2有两种，一种是cas9和gRNA分开的，先建stable cell line表达cas9，再用lenti-
: gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
: [在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
: ：大谢！
: ：
: ：...........
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O**********a
发帖数: 317 | 7 请教真不敢当，你是前辈。
我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
合在一个载体的也可以，如果你喜欢。看你偏好了。
建stable cell line也不难啊，两到三周。
我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章，说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天
。要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
：
：........... |
m*********D
发帖数: 1727 | 8 大概你的ES长得快。我建一个，至少得一个多月呢。筛选也得两个礼拜到三个礼拜，然
后characterization。上几个月帮一个学生建，他那个细胞长得太慢，doubling time
是两天，结果花了三个月才拿到stable cell lines。
我知道你说的那篇Nature Biotechlogy文章，是老鼠的。也在研究那篇文章。就是这个
sequence部分不太懂。哎，作研究，年龄是大了点，没跟上bioinformatics这些新东西
，越看越糊涂。
谢谢！有问题还会上来找你和其他同行。Have a nice evening!
cas9
【在 O**********a 的大作中提到】
: 请教真不敢当，你是前辈。
: 我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
: 合在一个载体的也可以，如果你喜欢。看你偏好了。
: 建stable cell line也不难啊，两到三周。
: 我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章，说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
: 就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
: [在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
: ：他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天
: 。要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
: ：
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Z**Q
发帖数: 48 | 9 耐药不仅和基因突变有关，更和蛋白翻译后修饰相关，磷酸化，泛素化，等等。自噬的
增强就是这些修饰的改变引起的。 |
y****m
发帖数: 37 | 10 in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
common false positives in any genome-wide screens.
【在 O**********a 的大作中提到】
: 测guide RNA，因为整合到genome上了。用通用引物扩增，测里面的gRNA序列。比测
: mRNA好。
: 数据分析很简单，因为序列都是知道的，看哪些序列被富集，就是tatget seq 。要的
: 通量很小的
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O**********a
发帖数: 317 | 11 不表达的就不会work，也不会被筛选富集啊
[在 yyadam (sunwind) 的大作中提到：]
：in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
which are
：common false positives in any genome-wide screens.
：........... |
m*********D
发帖数: 1727 | 12 你说的是。但没有一个办法可以找到所有可能的原因，就从这个开始。实际上IP也在考
虑之中。因我前面用CRISPR作了点突变，对这个方面熟悉，老板自然就让我往这方面看
看。如果可能，找到几个cadidates,自然就给实验室打开了及格不同的课题，每个学生
可以作一个感兴趣的方向。而我就是打酱油的：没人愿意作或给实验室打基础的
project,往往就是我来承担。当然，工作也轻松一些，常常没有自己的project.：（。
【在 Z**Q 的大作中提到】
: 耐药不仅和基因突变有关，更和蛋白翻译后修饰相关，磷酸化，泛素化，等等。自噬的
: 增强就是这些修饰的改变引起的。
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
所以，就想自己试试。
谢谢！
gRNA
【在 y****m 的大作中提到】
: in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
: integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
: common false positives in any genome-wide screens.
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O**********a
发帖数: 317 | 14 这种不整合又有功能的几率是很小的吧。漏掉了没关系。
细胞MOI控制在0.3，目的是尽可能的每个细胞一个病毒一个gRNA，所以起始量也得大一
点吧。
我用过50X10^6个细胞。记得他文章是100X10^6个细胞吧。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
: function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
: puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
: 为sequencing整个genome来找呢。
: 既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
: 的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
: Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
: 不是很高这个因素。
: 我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
: 所以，就想自己试试。
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m*********D
发帖数: 1727 | 15 严格地说，我不知道“不整合又有功能的几率”。你的ES可能integration的概率高一
些，我以前作过knockout老鼠的stem cell。平常用cnacer cell line作stable,反正拿
到的效率很低。除了transfection的效率低，integration的概率低可能也是原因。
他那个300X的library coverage,不知道是不是考虑到这个因素，我的理解是每个guide
RNA有300个机会（转进细胞），加上一个gene有三个guide sequences,就是每个基因
平均有900的机会，这样也许能compensate integration的概率低？我的瞎理解。
100M的细胞，大约是10个T75 flask,我应该能对付。：）。
【在 O**********a 的大作中提到】
: 这种不整合又有功能的几率是很小的吧。漏掉了没关系。
: 细胞MOI控制在0.3，目的是尽可能的每个细胞一个病毒一个gRNA，所以起始量也得大一
: 点吧。
: 我用过50X10^6个细胞。记得他文章是100X10^6个细胞吧。
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O**********a
发帖数: 317 | 16 发个邮件或者去他那个google group论坛上问他。feng zhang人很好，会回答或者他的
手下会回答的。
https://groups.google.com/forum/#!forum/crispr
guide
【在 m*********D 的大作中提到】
: 严格地说，我不知道“不整合又有功能的几率”。你的ES可能integration的概率高一
: 些，我以前作过knockout老鼠的stem cell。平常用cnacer cell line作stable,反正拿
: 到的效率很低。除了transfection的效率低，integration的概率低可能也是原因。
: 他那个300X的library coverage,不知道是不是考虑到这个因素，我的理解是每个guide
: RNA有300个机会（转进细胞），加上一个gene有三个guide sequences,就是每个基因
: 平均有900的机会，这样也许能compensate integration的概率低？我的瞎理解。
: 100M的细胞，大约是10个T75 flask,我应该能对付。：）。
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 大谢！发贴前可以先读不少东西！
【在 O**********a 的大作中提到】
: 发个邮件或者去他那个google group论坛上问他。feng zhang人很好，会回答或者他的
: 手下会回答的。
: https://groups.google.com/forum/#!forum/crispr
:
: guide
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y****m
发帖数: 37 | 18 In a ideal world, yes. In reality, no.
plus, it will increase noise in T0
【在 O**********a 的大作中提到】
: 不表达的就不会work，也不会被筛选富集啊
: [在 yyadam (sunwind) 的大作中提到：]
: ：in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
: gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
: which are
: ：common false positives in any genome-wide screens.
: ：...........
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