f*******d
发帖数: 92 | 1 虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line， 做之前请教一下做
过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid， 怎么选择位点呢？酶切之
后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
谢啦～ |
m***y
发帖数: 627 | 2 可以切也可以不切
酶切选择的时候肯定是单位点，不要切坏抗性序列，不要切坏你的kd or tag-your
gene序列
切后可以用乙醇沉淀回收
pcDNA6可以用来建立stable cell line |
m*********D
发帖数: 1727 | 3 看你的selection marker和要表达的基因是不是在同一个vector上。不是的话，你两个
都要切。
以前作knockout的时候，读过的资料是这么解释的：所有integration都是因同源
sequence导致的。一个圆的plasmid,一个点和genoome的一个点match后，integration
往往就是一个copy进去，而一个线性的DNA片断，往往会有很多拷贝进同一个点。你要
有两个plasmid，你就只能切了，不然，两个不同点的integration很难同时在一个细胞
里发生。我作stable,都切，希望一下子能多进几个拷贝。另外，环状的plasmid的
integration可以发生在plasmid的任何地方，如果正好发生在你的expression
cassette之类，就是integrated,也可能不表达你要的东西。
切点很容易，就是找一个酶位点，只要在你的expression cassette（包括你自己的基
因和selection marker)之外就行。你知道vector的来源的话，一般公司的网站上会有
map告诉你这些cassette的起点和终点的。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line， 做之前请教一下做
: 过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid， 怎么选择位点呢？酶切之
: 后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
: 此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
: 谢啦～
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D***a
发帖数: 516 | 4 amp抗性的质粒可以选择scaI或PvuI
kan抗性的可以选择puvI，NruI或SspI
都是细菌抗性基因上的位点。 |
m******o
发帖数: 8504 | 5 我天天在做，不用切的，只要表达效率高，筛选过后，很容易挑到正确的 |
f*******d
发帖数: 92 | 6 多谢各位前辈指点！
再问一下筛选的方法。是不是平板转化之后两三天换成抗性筛选培养基，然后一个星期
之后细胞死了一大半只剩下稳定转化的了，这个时候就稀释，然后seed 1－2个细胞到
96孔板里养single colony?
这个还是工作量挺大大，显微镜下面96个孔全部看一遍都要好久，如果几个板看下来一
天就不用干其它活了。。。。
大家通常筛选有啥简单有效的好办法呢？ |
s********r
发帖数: 312 | 7 转染效率高的话不需要做single colony，推荐用piggybac系统，超级方便，不用挑克
隆，筛一个星期就能养起来做实验了。 |
m*********D
发帖数: 1727 | 8 转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
有问题。
看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
的tip，在显微镜下挑。
挑的过程如下：
100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指
一松，就把那团细胞吸进了tip。这20 ul的细胞带PBS放进96-well的平板里，加20 ul
trypsin, RT处理5-10分钟，加100 ul medium就可以转移到别的平板里了。看colony大
小，很多时候我就直接进24-well plate,然后进T25。挑之前最好不要喝咖啡，尤其加
糖的咖啡，防止手哆嗦。：）。
Good luck!
【在 f*******d 的大作中提到】
: 多谢各位前辈指点！
: 再问一下筛选的方法。是不是平板转化之后两三天换成抗性筛选培养基，然后一个星期
: 之后细胞死了一大半只剩下稳定转化的了，这个时候就稀释，然后seed 1－2个细胞到
: 96孔板里养single colony?
: 这个还是工作量挺大大，显微镜下面96个孔全部看一遍都要好久，如果几个板看下来一
: 天就不用干其它活了。。。。
: 大家通常筛选有啥简单有效的好办法呢？
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f*******d
发帖数: 92 | 9 这个好详细好详细！多谢指点！
dish
【在 m*********D 的大作中提到】
: 转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
: 在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
: 有问题。
: 看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
: 100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
: 的tip，在显微镜下挑。
: 挑的过程如下：
: 100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
: 的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
: pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指
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s******y
发帖数: 28562 | 10
切之后的效率会高一些。切的位点离你的基因的两头越远越好。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line， 做之前请教一下做
: 过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid， 怎么选择位点呢？酶切之
: 后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
: 此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
: 谢啦～
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