E*********4 发帖数: 16 | 1 知道本版的牛人非常多,全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上,然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒(在
293T里面可以检测到蛋白表达)。问题是empty vector很顺利,但是我们的蛋白没有办
法产生病毒,或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors,同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性,于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白,还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候,缺了或者多了什么部件?插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest,没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail,同样无果。如果实在无解,我们已经考虑要包给公司做了,但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津!跪谢! |
h******y 发帖数: 351 | 2 lenti 包装容量有限。你的基因有多大?
sites
【在 E*********4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 知道本版的牛人非常多,全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela : lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag : vector上面subclone到另一个lentivirus vector上,然后在Hela里面建立over- : expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒(在 : 293T里面可以检测到蛋白表达)。问题是empty vector很顺利,但是我们的蛋白没有办 : 法产生病毒,或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的 : lentivirus expression vectors,同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒 : 性,于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白,还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做 : subcloning的时候,缺了或者多了什么部件?插入的位点是在multiple cloning sites : . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest,没有polyA tail。之前也试过包括
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E*********4 发帖数: 16 | 3 只有1.8kb
【在 h******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : lenti 包装容量有限。你的基因有多大? : : sites
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v********e 发帖数: 1597 | 4 这种情况你只能一一排除,
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率,这种试验,可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题,
第二,你可以拿上清去测P24,检测一下你包的病毒怎么样?或者拿第二次(我一般收
集两次,第一次是转染293T后的24小时,第二次是第一次收集后的24小时,然后用第二
次收集的做转导)收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag-tag是不是好用?有些情况下,不好用,除非你已经用这种构建表达过
蛋白,也可以检测的到 |
E*********4 发帖数: 16 | 5 我的这个载体就带有GFP,所以看到的结果是,空载体包装病毒没有问题,感染Hela效
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑,完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒?关于Flag-tag,在293T里面可以检测到,信号很强。
谢谢分享经验!
【在 v********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这种情况你只能一一排除, : 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率,这种试验,可以找携带GFP的假病毒做。如果效 : 率不是问题, : 第二,你可以拿上清去测P24,检测一下你包的病毒怎么样?或者拿第二次(我一般收 : 集两次,第一次是转染293T后的24小时,第二次是第一次收集后的24小时,然后用第二 : 次收集的做转导)收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒 : 第三你的flag-tag是不是好用?有些情况下,不好用,除非你已经用这种构建表达过 : 蛋白,也可以检测的到
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v********e 发帖数: 1597 | 6 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白?还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
哪个在前哪个在后?如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我的这个载体就带有GFP,所以看到的结果是,空载体包装病毒没有问题,感染Hela效 : 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑,完全没有GFP。这是不 : 是说明病毒没有包装我的质粒?关于Flag-tag,在293T里面可以检测到,信号很强。 : 谢谢分享经验!
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F******p 发帖数: 2099 | 7 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序, 可能序列有了问题。 |
Z******5 发帖数: 435 | 8 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。 |
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Z******5 发帖数: 435 | 9 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。 |
a*******a 发帖数: 4233 | 10 要看ltr到ltr的总长度。1.8k不小了,如果你的载体里面本来花样就不少,那么插进你
的片段以后可能会超过上限,病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少,
【在 E*********4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 只有1.8kb
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p****t 发帖数: 18 | 11 请教一下,为什么要用lentivirus?如果只是做过表达细胞系,直接nucleofection然
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗?
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【在 E*********4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 知道本版的牛人非常多,全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela : lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag : vector上面subclone到另一个lentivirus vector上,然后在Hela里面建立over- : expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒(在 : 293T里面可以检测到蛋白表达)。问题是empty vector很顺利,但是我们的蛋白没有办 : 法产生病毒,或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的 : lentivirus expression vectors,同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒 : 性,于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白,还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做 : subcloning的时候,缺了或者多了什么部件?插入的位点是在multiple cloning sites : . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest,没有polyA tail。之前也试过包括
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E*********4 发帖数: 16 | 12 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
谢谢!
列?
【在 v********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白?还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列? : 哪个在前哪个在后?如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
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E*********4 发帖数: 16 | 13 全质粒都要测么?有可能是哪一段出了问题吗?
谢谢!
【在 F******p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序, 可能序列有了问题。
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E*********4 发帖数: 16 | 14 已经做了,在293T里做transient expression,GFP有很强的信号,蛋白也表达,也有
Flag。
谢谢!
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
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E*********4 发帖数: 16 | 15 想要做成stable cell line,用病毒的话效率会很高。如果直接转染,也可以整合到基
因组,就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教一下,为什么要用lentivirus?如果只是做过表达细胞系,直接nucleofection然 : 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗? : : sites
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v********e 发帖数: 1597 | 16 这种情况十有八九你包病毒出了问题,建议换一个系统看看,我们通常用的是plenti_
GFP GFP可以用其他基因替换,然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装,从来没遇到过问题,
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。 : 谢谢! : : 列?
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