E*********4
发帖数: 16 | 1 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail，同样无果。如果实在无解，我们已经考虑要包给公司做了，但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津！跪谢！ |
h******y
发帖数: 351 | 2 lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
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E*********4
发帖数: 16 | 3 只有1.8kb
【在 h******y 的大作中提到】
: lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
:
: sites
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v********e
发帖数: 1597 | 4 这种情况你只能一一排除，
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到 |
E*********4
发帖数: 16 | 5 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
谢谢分享经验！
【在 v********e 的大作中提到】
: 这种情况你只能一一排除，
: 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
: 率不是问题，
: 第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
: 集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
: 次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
: 第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
: 蛋白，也可以检测的到
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v********e
发帖数: 1597 | 6 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】
: 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
: 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
: 是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
: 谢谢分享经验！
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F******p
发帖数: 2099 | 7 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。 |
Z******5
发帖数: 435 | 8 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 9 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。 |
a*******a
发帖数: 4233 | 10 要看ltr到ltr的总长度。1.8k不小了，如果你的载体里面本来花样就不少，那么插进你
的片段以后可能会超过上限，病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少，
【在 E*********4 的大作中提到】
: 只有1.8kb
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p****t
发帖数: 18 | 11 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
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E*********4
发帖数: 16 | 12 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
谢谢！
列?
【在 v********e 的大作中提到】
: 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
: 哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
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E*********4
发帖数: 16 | 13 全质粒都要测么？有可能是哪一段出了问题吗？
谢谢！
【在 F******p 的大作中提到】
: 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
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E*********4
发帖数: 16 | 14 已经做了，在293T里做transient expression，GFP有很强的信号，蛋白也表达，也有
Flag。
谢谢！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
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E*********4
发帖数: 16 | 15 想要做成stable cell line，用病毒的话效率会很高。如果直接转染，也可以整合到基
因组，就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】
: 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
: 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
:
: sites
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v********e
发帖数: 1597 | 16 这种情况十有八九你包病毒出了问题，建议换一个系统看看，我们通常用的是plenti_
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】
: 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
: 谢谢！
:
: 列?
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