r***l 发帖数: 593 | 1 我们用预先导入A基因的Phoenix-ECO cell去转染T cell,但是flow看不到A基因的表达
。人家说你可以先run flow看看Phoenix-ECO cell里面这个基因是否表达?
很好奇Phoenix-ECO cell会直接表达这个基因吗?用PCR check是不是有A基因的DNA才
对吧?
不是很懂,请大侠帮忙看看,谢谢! |
s******s 发帖数: 13035 | 2 你用啥promoter?没有TF或者clone出错,
没有表达吗mRNA自然看不到。产病毒的时候,
有病毒RNA可以表达。
【在 r***l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们用预先导入A基因的Phoenix-ECO cell去转染T cell,但是flow看不到A基因的表达 : 。人家说你可以先run flow看看Phoenix-ECO cell里面这个基因是否表达? : 很好奇Phoenix-ECO cell会直接表达这个基因吗?用PCR check是不是有A基因的DNA才 : 对吧? : 不是很懂,请大侠帮忙看看,谢谢!
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C*******4 发帖数: 400 | 3 应该会表达,试试包装一个GFP的病毒重复一下你的实验你就能看到这个细胞里面有表
达(因为一般是做转染瞬间表达)。再用它感染你的T细胞。就可以直接检测荧光赖看
表达了,在知道大概的感染效率之后再做FLOW才有意义因为有时候病毒滴度太低你的检
测很难。。 |
s******s 发帖数: 13035 | 4 包装细胞里面表达不等于在实验细胞里面表达。我前面说了,实验细胞里面是否表达
取决于promoter,包装细胞估计产生的病毒RNA直接当mRNA用了,所以总是有表达。
【在 C*******4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 应该会表达,试试包装一个GFP的病毒重复一下你的实验你就能看到这个细胞里面有表 : 达(因为一般是做转染瞬间表达)。再用它感染你的T细胞。就可以直接检测荧光赖看 : 表达了,在知道大概的感染效率之后再做FLOW才有意义因为有时候病毒滴度太低你的检 : 测很难。。
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r***l 发帖数: 593 | 5 谢谢大家,检测了发现包装细胞有表达,就是转染后没有,可能没转进去!
t cell好难转-_-|| |
C*******4 发帖数: 400 | 6 呵呵,我们说的没矛盾啊。一般用CMV启动子在实验细胞里面应该有表达。
他的问题可能是病毒滴度低,所有我要他从头开始就用GFP做快检的指针。
再有,如果是RETRO病毒,碰到不怎么分裂的细胞转导效率很低。可以用LENTI病毒做。
即使病毒没大问题,转导的条件有时候是比较TRICKY的。
的检
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 包装细胞里面表达不等于在实验细胞里面表达。我前面说了,实验细胞里面是否表达 : 取决于promoter,包装细胞估计产生的病毒RNA直接当mRNA用了,所以总是有表达。
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s******s 发帖数: 13035 | 7 嗯。不过CMV最好早点看,有些细胞里面会被silence掉
有表
赖看
【在 C*******4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 呵呵,我们说的没矛盾啊。一般用CMV启动子在实验细胞里面应该有表达。 : 他的问题可能是病毒滴度低,所有我要他从头开始就用GFP做快检的指针。 : 再有,如果是RETRO病毒,碰到不怎么分裂的细胞转导效率很低。可以用LENTI病毒做。 : 即使病毒没大问题,转导的条件有时候是比较TRICKY的。 : : 的检
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r***l 发帖数: 593 | 8 ,确实是retro,所以条件很难摸!
有表
赖看
【在 C*******4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 呵呵,我们说的没矛盾啊。一般用CMV启动子在实验细胞里面应该有表达。 : 他的问题可能是病毒滴度低,所有我要他从头开始就用GFP做快检的指针。 : 再有,如果是RETRO病毒,碰到不怎么分裂的细胞转导效率很低。可以用LENTI病毒做。 : 即使病毒没大问题,转导的条件有时候是比较TRICKY的。 : : 的检
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