c********6
发帖数: 693 | 1 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。 |
m*********D
发帖数: 1727 | 2 你是说发一个method? 关键是你真要引进一个mutation的时候，你这插入的两个“带有
不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
颜色的template，会有疑问。
我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
确实比较费劲。 |
b******c
发帖数: 27 | |
c********6
发帖数: 693 | 4 你们是在什么细胞系里边做的呢？
这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
有问题的。
通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
homozygous
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你是说发一个method? 关键是你真要引进一个mutation的时候，你这插入的两个“带有
: 不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
: 达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
: BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
: 颜色的template，会有疑问。
: 我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
: 的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
: 1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
: 了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
: mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
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c********6
发帖数: 693 | 5 这个思路跟这两篇文章完全不一样，我所想的那个没有办法用于in vivo的提高效率，
而只是把突变成功的细胞高效的筛选出来，本身不能提高重组效率。
【在 b******c 的大作中提到】
: 有几篇和你的想法类似的文章都发的高点数期刊。支持。
: http://www.nature.com/nbt/journal/v33/n5/full/nbt.3198.html
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(15)00004
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m*********D
发帖数: 1727 | 6 哦，我用癌细胞。
以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
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s******y
发帖数: 28562 | 7 我怎么觉得你说的这个方法其实是得到homogzygous 的一种标准方法吧？
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
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c********6
发帖数: 693 | 8 还不是标准方法，现在大多数是只用一种荧光，然后再从带有荧光的细胞里边筛hetero
和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
就是homozygous的
【在 s******y 的大作中提到】
: 我怎么觉得你说的这个方法其实是得到homogzygous 的一种标准方法吧？
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c********6
发帖数: 693 | 9 piggybac系统是可以做到完全foot-print free的
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哦，我用癌细胞。
: 以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
: 你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
:
: 变。
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s******y
发帖数: 28562 | 10 去年就有人在这个网上说过这个方法了，所以我有印象。
除非那个方法只是大家都知道的土法子而没有人发表过。
hetero
【在 c********6 的大作中提到】
: 还不是标准方法，现在大多数是只用一种荧光，然后再从带有荧光的细胞里边筛hetero
: 和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
: 就是homozygous的
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z****u
发帖数: 1007 | 11 不太明白这点，piggybac过表达难道不是引起transpose跳转吗？不明白为啥会把俩itr
间的序列切除掉？
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
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s******r
发帖数: 1245 | 12 TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
候split，看光源用了几个wavelength。
所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
好像我都是在泼冷水，抱歉。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
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j******i
发帖数: 939 | 13 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧 |
c********6
发帖数: 693 | 14 我觉得你说的非常有道理，我个人也不太看好这个。我去查找一下那个TALEN 加双色的
系统，好让我老板看看，让他冷静下来。
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
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c********6
发帖数: 693 | 15 在人的干细胞里边，除非你使用那个ssODN，这个据很多人反馈是你不筛够2000个克隆
，想都不用想成功。另外能够想到的foot-print free的编辑方法就是结合piggyBac了。
确实不太方便，文章里边报道的加个HSV-DTK，使用FIAU做阴性筛选，百分之60-70.实
际效果是，筛选70-80个克隆，有一个抗FIAU的克隆是成功去除掉了筛选标签。
【在 j******i 的大作中提到】
: 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
: piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧
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c********6
发帖数: 693 | 16 你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
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z*t
发帖数: 863 | 17 兄弟你看看这篇文章，这也是大家已经很熟悉的topic和方法，这篇文章就卖到了CSC
http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
【在 c********6 的大作中提到】
: 你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
: 使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
: 能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
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c********6
发帖数: 693 | 18 多谢这篇有用的文章，但是他们是用两种带有不同的抗生素donor做模板去构建一个
iCAS细胞系。有没有那种使用两种不同荧光donor构建细胞系的文章呢
【在 z*t 的大作中提到】
: 兄弟你看看这篇文章，这也是大家已经很熟悉的topic和方法，这篇文章就卖到了CSC
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
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c********6
发帖数: 693 | |
e*********6
发帖数: 3453 | 20 好好组织下，如果写的不错，投在plos one应该能发
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
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