z********i
发帖数: 610 | 1 找到了两个相互作用的蛋白，各种生物物理的方法证明了他们之间的直接相互作用。但
是，这个两个蛋白公转到hela细胞中，看不到任何的共定位。其中一个蛋白和cilia形
成相关，能到看到它定位在basal body，另一个蛋白功能未知，弥散分布在细胞中，细
胞核信号强一点。自己不是做cilia，对这块不熟悉。请教各位大牛，如何才能看到共
定位？谢谢！ |
g*****n
发帖数: 250 | 2 你认为那两个蛋白应该在哪种细胞里相互作用，就用那种细胞。co-ip 和 PLA (
proximity ligation assay)可能是快捷的方法。也可以在含有那种细胞的组织上做PLA
。 |
z********i
发帖数: 610 | 3 多谢回复。我现在困惑的是看不到这两个蛋白在细胞中的共定位。至于他们直接的相互
作用，我们已经用多种方法确认，表明他们之间是直接的相互作用。
PLA
【在 g*****n 的大作中提到】
: 你认为那两个蛋白应该在哪种细胞里相互作用，就用那种细胞。co-ip 和 PLA (
: proximity ligation assay)可能是快捷的方法。也可以在含有那种细胞的组织上做PLA
: 。
|
g*****n
发帖数: 250 | 4 生物物理的方法证明他们相互作用，并不表明他们在细胞里相互作用。在细胞里共定位
（免疫双染）也不表明他们直接相互作用。在组织上做PLA，加上细胞识别，是个可靠
的方法。 |
D***a
发帖数: 516 | 5 我觉得proximity ligation assay检测共定位真是一个靠不住的实验，无论什么两个蛋
白，或多或少总会有阳性信号。只是一个锦上添花的结果，不能一锤定音。 |
l******n
发帖数: 298 | 6 两个蛋白共转到细胞里。这两个蛋白你可能不是full length?蛋白构想发生变法？
各种生物物理的方法证明了他们之间的直接相互作用。 结合位点在什么地方做了吗？ |
i*********0
发帖数: 915 | 7 有同感。
【在 D***a 的大作中提到】
: 我觉得proximity ligation assay检测共定位真是一个靠不住的实验，无论什么两个蛋
: 白，或多或少总会有阳性信号。只是一个锦上添花的结果，不能一锤定音。
|
z********i
发帖数: 610 | 8 首先我用IP找到了他们相互作用的domain，一个是全长，另一个蛋白是一个domain；然
后在体外表达并纯化了这个单白，pulldown和native gel，都能都看到很强的相互作用
。作用的位点也找到了，突变之后能减弱相互作用。
【在 l******n 的大作中提到】
: 两个蛋白共转到细胞里。这两个蛋白你可能不是full length?蛋白构想发生变法？
: 各种生物物理的方法证明了他们之间的直接相互作用。 结合位点在什么地方做了吗？
|
H****N
发帖数: 997 | 9 How about doing co-IP with cell lysates after co-transfection? One
possibility is that they only co-localize and interact with other under
specific conditions. |
p****t
发帖数: 18 | 10 另一个功能未知的蛋白可能没有表达成功，可以在C端连一个GFP看看亮不亮，或者转完
细胞之后做个 western 看看大小对不对。
固定之后用抗体看 endogenous 的这两个蛋白呢？这样子看到的共定位会比过表达更可
信。也许只是过表达之后 saturate binding site，所以看到的大部分 cytosolic。
还有一个可能性就是细胞在调控这个蛋白的相互作用，修饰之后就把interaction关掉
了，需要在特定情况才会去修饰。而纯化出来的蛋白没有修饰。 |
|
|
f*****f
发帖数: 195 | 11 basal body 蛋白跟细胞质蛋白有相互作用太正常了。basal body的这个蛋白主要的
pool可能并不在中心体上，他们的结合可能就发生在cytoplasm中，或是发生在basal
body targeting之前。另外很多中心体蛋白因为tag，fixation原因并不定位中心体，
弥散定位也有可能是假象。还有如果该功能未知蛋白是HSP或相关的，有假阳性可能。
【在 z********i 的大作中提到】
: 找到了两个相互作用的蛋白，各种生物物理的方法证明了他们之间的直接相互作用。但
: 是，这个两个蛋白公转到hela细胞中，看不到任何的共定位。其中一个蛋白和cilia形
: 成相关，能到看到它定位在basal body，另一个蛋白功能未知，弥散分布在细胞中，细
: 胞核信号强一点。自己不是做cilia，对这块不熟悉。请教各位大牛，如何才能看到共
: 定位？谢谢！
|
g*****n
发帖数: 250 | 12 lz的问题不是理论问题，而是技术问题。转染都做了，现在就是要看的是这两个蛋白是
否真的在自然条件下相互作用。再做转染方面的实验不会有帮助。剩下可用的方法就是
组织PLA了。另外，Y2H可以用，至少表明是在in vivo条件下。 |
b***r
发帖数: 390 | 13 这两种蛋白可以相互结合吗？ 在hela 细胞有表达吗？ 如果有，说不定你标价的蛋白
和细胞内的天然蛋白结合。 酵母双杂交不是可以观察蛋白之间的结合吗？ |
S**********e
发帖数: 620 | 14 哪个实验能一锤定音呢？两个蛋白搂在一起，还得证明他们真正干了什么才算术吧？
【在 D***a 的大作中提到】
: 我觉得proximity ligation assay检测共定位真是一个靠不住的实验，无论什么两个蛋
: 白，或多或少总会有阳性信号。只是一个锦上添花的结果，不能一锤定音。
|
a***h
发帖数: 82 | 15 这个似乎有涉及到是constant interaction还是transient的。两个蛋白即使in vitro
可以相互作用，但未必在细胞里可以检测得到吧，比如transient的可能就不能。 |
j*******u
发帖数: 81 | 16 蛋白相互作用从物理相互作用开始做是南辕北辙
现有功能readout
再回头做相互作用。
有功能没相互作用还能往下做
有相互作用没功能就废了 |
S**********e
发帖数: 620 | 17 你这个相当于先证明他们生了个娃，然后帮他们确定关系，transient就是419，
permanent就是领证了。
你这属于懒人方法，但是solid。只是找娃不是什么时候都那么容易。关键得要有灵感
，难！
【在 j*******u 的大作中提到】
: 蛋白相互作用从物理相互作用开始做是南辕北辙
: 现有功能readout
: 再回头做相互作用。
: 有功能没相互作用还能往下做
: 有相互作用没功能就废了
|
