p***7 发帖数: 535 | 1 大家好。再来请教HPLC,真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
我的目的是:定量植物中的Salicylic acid (SA)。用的 extraction internal
standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
好,可是最近不知什么原因,原本单一漂亮的SA的峰变成了两个:一个大的,一个很小
的。昨天换了个柱子注射同样的样品,发现SA的峰好了,但是o-anisic acid 又成了2
个,一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢?如果是柱子的原因,那如何改良
柱子呢?我中间没有做什么来改变柱子啊!真是奇怪。谢谢大家了。 |
t**n 发帖数: 4365 | 2 你得把HPLC条件贴上来,包括柱子、流动相、diluent,越具体越好。
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【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家好。再来请教HPLC,真是没有想到已经规范化的流程又会出错。 : 我的目的是:定量植物中的Salicylic acid (SA)。用的 extraction internal : standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很 : 好,可是最近不知什么原因,原本单一漂亮的SA的峰变成了两个:一个大的,一个很小 : 的。昨天换了个柱子注射同样的样品,发现SA的峰好了,但是o-anisic acid 又成了2 : 个,一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢?如果是柱子的原因,那如何改良 : 柱子呢?我中间没有做什么来改变柱子啊!真是奇怪。谢谢大家了。
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p***7 发帖数: 535 | |
s**********8 发帖数: 25265 | 4 it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka
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【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家好。再来请教HPLC,真是没有想到已经规范化的流程又会出错。 : 我的目的是:定量植物中的Salicylic acid (SA)。用的 extraction internal : standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很 : 好,可是最近不知什么原因,原本单一漂亮的SA的峰变成了两个:一个大的,一个很小 : 的。昨天换了个柱子注射同样的样品,发现SA的峰好了,但是o-anisic acid 又成了2 : 个,一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢?如果是柱子的原因,那如何改良 : 柱子呢?我中间没有做什么来改变柱子啊!真是奇怪。谢谢大家了。
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t**n 发帖数: 4365 | 5 most probably.
【在 s**********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka : : 2
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s**********8 发帖数: 25265 | 6 ft 随手一帖 里面几十个语法错误啊
【在 s**********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka : : 2
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s**********8 发帖数: 25265 | 7 你这个英文也不中
【在 t**n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : most probably.
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b****u 发帖数: 2771 | 8 你们规范化,肯定测 pH stability 吧
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【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家好。再来请教HPLC,真是没有想到已经规范化的流程又会出错。 : 我的目的是:定量植物中的Salicylic acid (SA)。用的 extraction internal : standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很 : 好,可是最近不知什么原因,原本单一漂亮的SA的峰变成了两个:一个大的,一个很小 : 的。昨天换了个柱子注射同样的样品,发现SA的峰好了,但是o-anisic acid 又成了2 : 个,一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢?如果是柱子的原因,那如何改良 : 柱子呢?我中间没有做什么来改变柱子啊!真是奇怪。谢谢大家了。
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a******z 发帖数: 1464 | 9 你怎么开始做坏人拉?
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你们规范化,肯定测 pH stability 吧 : : 2
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b****u 发帖数: 2771 | 10 做好人 受欺负啊
【在 a******z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你怎么开始做坏人拉?
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a******z 发帖数: 1464 | 11 谁欺负你啦?
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做好人 受欺负啊
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b****u 发帖数: 2771 | 12 呵呵 前老板
【在 a******z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谁欺负你啦?
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a******z 发帖数: 1464 | 13 不给你写推荐信?扣你工资了?
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 呵呵 前老板
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b****u 发帖数: 2771 | 14 压着paper 不发, 结果人家抢先了,
我把人paper 给他一份,他很懊悔, 不过反正走人了。
他倒想扣俺假期补偿工资,不了了之了。
【在 a******z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不给你写推荐信?扣你工资了?
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a******z 发帖数: 1464 | 15 可怜的,pat pat,发个包子安慰你把
已经开始新工作了?恭喜一下~
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 压着paper 不发, 结果人家抢先了, : 我把人paper 给他一份,他很懊悔, 不过反正走人了。 : 他倒想扣俺假期补偿工资,不了了之了。
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b****u 发帖数: 2771 | 16 算是开始了,忙着搬家,
多谢包子 呵呵
【在 a******z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 可怜的,pat pat,发个包子安慰你把 : 已经开始新工作了?恭喜一下~
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a******z 发帖数: 1464 | 17 很快呢~ 赞一个
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 算是开始了,忙着搬家, : 多谢包子 呵呵
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b****u 发帖数: 2771 | 18 现在好像回苏了,good luck
【在 a******z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 很快呢~ 赞一个
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a******z 发帖数: 1464 | 19 thx~
【在 b****u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 现在好像回苏了,good luck
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p***7 发帖数: 535 | 20 Here is the mobile phase
0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6
1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6
10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6
17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6
22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6
C18 reverse phase column Flurescence detector
Thanks so much |
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p***7 发帖数: 535 | 21 If it is true, why it is different between different columns while using the
same bottle of mobile phase on the same day? Thanks
【在 s**********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka : : 2
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b****u 发帖数: 2771 | 22
【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Here is the mobile phase : 0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6 : 1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6 : C18 reverse phase column Flurescence detector : Thanks so much
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t**n 发帖数: 4365 | 23 这个方法有问题,磷酸盐在ACN里溶解度很低,用90%的ACN洗柱子,非常容易造成buffe
r沉淀而堵塞柱子。
柱子被堵,会有double peak的现象出现。
【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Here is the mobile phase : 0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6 : 1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6 : 22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6 : C18 reverse phase column Flurescence detector : Thanks so much
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i*n 发帖数: 9793 | 24 泵要完蛋了
buffe
【在 t**n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个方法有问题,磷酸盐在ACN里溶解度很低,用90%的ACN洗柱子,非常容易造成buffe : r沉淀而堵塞柱子。 : 柱子被堵,会有double peak的现象出现。
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p***7 发帖数: 535 | 25 是的,是的。 前几天就出现了堵塞的情况。请问两位高人如何改良方法呢?真的非常
佩服。 |
p***7 发帖数: 535 | 26 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好? 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。
buffe
【在 t**n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个方法有问题,磷酸盐在ACN里溶解度很低,用90%的ACN洗柱子,非常容易造成buffe : r沉淀而堵塞柱子。 : 柱子被堵,会有double peak的现象出现。
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b*****r 发帖数: 203 | 27 Could there be oxidation happened to o-anisic acid?
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【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家好。再来请教HPLC,真是没有想到已经规范化的流程又会出错。 : 我的目的是:定量植物中的Salicylic acid (SA)。用的 extraction internal : standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很 : 好,可是最近不知什么原因,原本单一漂亮的SA的峰变成了两个:一个大的,一个很小 : 的。昨天换了个柱子注射同样的样品,发现SA的峰好了,但是o-anisic acid 又成了2 : 个,一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢?如果是柱子的原因,那如何改良 : 柱子呢?我中间没有做什么来改变柱子啊!真是奇怪。谢谢大家了。
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i*n 发帖数: 9793 | 28 你的峰是否出现在ACN梯度升到90%的时候,如果不是,没有必要把梯度弄这么高
,如果仅仅是为了洗干净柱子,应该在进下一针之前用无盐低梯度的流动相先洗去柱子
里的缓冲盐体系,再改用高梯度的ACN洗柱子。
如果非要高梯度流动相才能出峰,你可以考虑用甲醇和别的缓冲盐体系,比如甘氨酸缓
冲体系,粗略查了一下,也能缓冲到pH2.6,而且在甲醇里溶解度似乎还行。但是
不知道跟你这个分离检测体系有无矛盾,你要自己试试看
【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好? 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。 : : buffe
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i*n 发帖数: 9793 | 29 还有,一般C18柱适用的pH范围是2-8,你的流动相已经靠近极限了,时间长了
对柱子不太好
【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好? 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。 : : buffe
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t********e 发帖数: 107 | 30 pH 范围是可以,现在很多柱子都用pure silica bonding,这么低的pH值可以试试有机酸啊。 |
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t**n 发帖数: 4365 | 31 20mM的磷酸盐,最多70%ACN
【在 p***7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好? 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。 : : buffe
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t**n 发帖数: 4365 | 32 SA在C18上保留时间很短
【在 i*n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的峰是否出现在ACN梯度升到90%的时候,如果不是,没有必要把梯度弄这么高 : ,如果仅仅是为了洗干净柱子,应该在进下一针之前用无盐低梯度的流动相先洗去柱子 : 里的缓冲盐体系,再改用高梯度的ACN洗柱子。 : 如果非要高梯度流动相才能出峰,你可以考虑用甲醇和别的缓冲盐体系,比如甘氨酸缓 : 冲体系,粗略查了一下,也能缓冲到pH2.6,而且在甲醇里溶解度似乎还行。但是 : 不知道跟你这个分离检测体系有无矛盾,你要自己试试看
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l****o 发帖数: 58 | |
i*n 发帖数: 9793 | 34 用三氟乙酸干吗?
【在 l****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 为什么不用三氟乙酸?
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p***7 发帖数: 535 | 35 大家有没有改良的mobile phase? 但是我不想再换试剂了,因为没有时间了。
只是想换换梯度。谢谢。 |