p***7
发帖数: 535 | 1 大家好。再来请教HPLC，真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
我的目的是：定量植物中的Salicylic acid （SA）。用的 extraction internal
standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
好，可是最近不知什么原因，原本单一漂亮的SA的峰变成了两个：一个大的，一个很小
的。昨天换了个柱子注射同样的样品，发现SA的峰好了，但是o-anisic acid 又成了2
个，一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢？如果是柱子的原因，那如何改良
柱子呢？我中间没有做什么来改变柱子啊！真是奇怪。谢谢大家了。 |
t**n
发帖数: 4365 | 2 你得把HPLC条件贴上来，包括柱子、流动相、diluent，越具体越好。
2
【在 p***7 的大作中提到】
: 大家好。再来请教HPLC，真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
: 我的目的是：定量植物中的Salicylic acid （SA）。用的 extraction internal
: standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
: 好，可是最近不知什么原因，原本单一漂亮的SA的峰变成了两个：一个大的，一个很小
: 的。昨天换了个柱子注射同样的样品，发现SA的峰好了，但是o-anisic acid 又成了2
: 个，一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢？如果是柱子的原因，那如何改良
: 柱子呢？我中间没有做什么来改变柱子啊！真是奇怪。谢谢大家了。
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p***7
发帖数: 535 | |
s**********8
发帖数: 25265 | 4 it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka
2
【在 p***7 的大作中提到】
: 大家好。再来请教HPLC，真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
: 我的目的是：定量植物中的Salicylic acid （SA）。用的 extraction internal
: standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
: 好，可是最近不知什么原因，原本单一漂亮的SA的峰变成了两个：一个大的，一个很小
: 的。昨天换了个柱子注射同样的样品，发现SA的峰好了，但是o-anisic acid 又成了2
: 个，一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢？如果是柱子的原因，那如何改良
: 柱子呢？我中间没有做什么来改变柱子啊！真是奇怪。谢谢大家了。
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t**n
发帖数: 4365 | 5 most probably.
【在 s**********8 的大作中提到】
: it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka
:
: 2
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s**********8
发帖数: 25265 | 6 ft 随手一帖 里面几十个语法错误啊
【在 s**********8 的大作中提到】
: it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka
:
: 2
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s**********8
发帖数: 25265 | 7 你这个英文也不中
【在 t**n 的大作中提到】
: most probably.
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b****u
发帖数: 2771 | 8 你们规范化，肯定测 pH stability 吧
2
【在 p***7 的大作中提到】
: 大家好。再来请教HPLC，真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
: 我的目的是：定量植物中的Salicylic acid （SA）。用的 extraction internal
: standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
: 好，可是最近不知什么原因，原本单一漂亮的SA的峰变成了两个：一个大的，一个很小
: 的。昨天换了个柱子注射同样的样品，发现SA的峰好了，但是o-anisic acid 又成了2
: 个，一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢？如果是柱子的原因，那如何改良
: 柱子呢？我中间没有做什么来改变柱子啊！真是奇怪。谢谢大家了。
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a******z
发帖数: 1464 | 9 你怎么开始做坏人拉？
【在 b****u 的大作中提到】
: 你们规范化，肯定测 pH stability 吧
:
: 2
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b****u
发帖数: 2771 | 10 做好人 受欺负啊
【在 a******z 的大作中提到】
: 你怎么开始做坏人拉？
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a******z
发帖数: 1464 | 11 谁欺负你啦？
【在 b****u 的大作中提到】
: 做好人 受欺负啊
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b****u
发帖数: 2771 | 12 呵呵 前老板
【在 a******z 的大作中提到】
: 谁欺负你啦？
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a******z
发帖数: 1464 | 13 不给你写推荐信？扣你工资了？
【在 b****u 的大作中提到】
: 呵呵 前老板
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b****u
发帖数: 2771 | 14 压着paper 不发， 结果人家抢先了，
我把人paper 给他一份，他很懊悔， 不过反正走人了。
他倒想扣俺假期补偿工资，不了了之了。
【在 a******z 的大作中提到】
: 不给你写推荐信？扣你工资了？
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a******z
发帖数: 1464 | 15 可怜的，pat pat，发个包子安慰你把
已经开始新工作了？恭喜一下~
【在 b****u 的大作中提到】
: 压着paper 不发， 结果人家抢先了，
: 我把人paper 给他一份，他很懊悔， 不过反正走人了。
: 他倒想扣俺假期补偿工资，不了了之了。
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b****u
发帖数: 2771 | 16 算是开始了，忙着搬家，
多谢包子 呵呵
【在 a******z 的大作中提到】
: 可怜的，pat pat，发个包子安慰你把
: 已经开始新工作了？恭喜一下~
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a******z
发帖数: 1464 | 17 很快呢~ 赞一个
【在 b****u 的大作中提到】
: 算是开始了，忙着搬家，
: 多谢包子 呵呵
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b****u
发帖数: 2771 | 18 现在好像回苏了，good luck
【在 a******z 的大作中提到】
: 很快呢~ 赞一个
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a******z
发帖数: 1464 | 19 thx~
【在 b****u 的大作中提到】
: 现在好像回苏了，good luck
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p***7
发帖数: 535 | 20 Here is the mobile phase
0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6
1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6
10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6
17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6
22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6
C18 reverse phase column Flurescence detector
Thanks so much |
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p***7
发帖数: 535 | 21 If it is true, why it is different between different columns while using the
same bottle of mobile phase on the same day? Thanks
【在 s**********8 的大作中提到】
: it may due to pka issue. two ionic form. try pH two units away of two pka
:
: 2
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b****u
发帖数: 2771 | 22
【在 p***7 的大作中提到】
: Here is the mobile phase
: 0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6
: 1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6
: C18 reverse phase column Flurescence detector
: Thanks so much
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t**n
发帖数: 4365 | 23 这个方法有问题，磷酸盐在ACN里溶解度很低，用90%的ACN洗柱子，非常容易造成buffe
r沉淀而堵塞柱子。
柱子被堵，会有double peak的现象出现。
【在 p***7 的大作中提到】
: Here is the mobile phase
: 0-1min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 pH2.6
: 1-10min 20% acetonitrile 80% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 10-17.5min 55% acetonitrile 45% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 17.5-22.5 min 90% acetonitrile 10% 20mM KH2PO4 PH2.6
: 22.5-27.5 min 15% acetonitrile 85% 20mM KH2PO4 PH 2.6
: C18 reverse phase column Flurescence detector
: Thanks so much
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i*n
发帖数: 9793 | 24 泵要完蛋了
buffe
【在 t**n 的大作中提到】
: 这个方法有问题，磷酸盐在ACN里溶解度很低，用90%的ACN洗柱子，非常容易造成buffe
: r沉淀而堵塞柱子。
: 柱子被堵，会有double peak的现象出现。
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p***7
发帖数: 535 | 25 是的，是的。 前几天就出现了堵塞的情况。请问两位高人如何改良方法呢？真的非常
佩服。 |
p***7
发帖数: 535 | 26 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好？ 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。
buffe
【在 t**n 的大作中提到】
: 这个方法有问题，磷酸盐在ACN里溶解度很低，用90%的ACN洗柱子，非常容易造成buffe
: r沉淀而堵塞柱子。
: 柱子被堵，会有double peak的现象出现。
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b*****r
发帖数: 203 | 27 Could there be oxidation happened to o-anisic acid?
2
【在 p***7 的大作中提到】
: 大家好。再来请教HPLC，真是没有想到已经规范化的流程又会出错。
: 我的目的是：定量植物中的Salicylic acid （SA）。用的 extraction internal
: standard 是o-anisic acid. 流动相可以把o-anisic acid 和SA 分开。前几天一直很
: 好，可是最近不知什么原因，原本单一漂亮的SA的峰变成了两个：一个大的，一个很小
: 的。昨天换了个柱子注射同样的样品，发现SA的峰好了，但是o-anisic acid 又成了2
: 个，一个大的和一个很小的。为什么会这么不稳定呢？如果是柱子的原因，那如何改良
: 柱子呢？我中间没有做什么来改变柱子啊！真是奇怪。谢谢大家了。
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i*n
发帖数: 9793 | 28 你的峰是否出现在ＡＣＮ梯度升到９０％的时候，如果不是，没有必要把梯度弄这么高
，如果仅仅是为了洗干净柱子，应该在进下一针之前用无盐低梯度的流动相先洗去柱子
里的缓冲盐体系，再改用高梯度的ＡＣＮ洗柱子。
如果非要高梯度流动相才能出峰，你可以考虑用甲醇和别的缓冲盐体系，比如甘氨酸缓
冲体系，粗略查了一下，也能缓冲到ｐＨ２．６，而且在甲醇里溶解度似乎还行。但是
不知道跟你这个分离检测体系有无矛盾，你要自己试试看
【在 p***7 的大作中提到】
: 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好？ 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。
:
: buffe
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i*n
发帖数: 9793 | 29 还有，一般Ｃ１８柱适用的ｐＨ范围是２－８，你的流动相已经靠近极限了，时间长了
对柱子不太好
【在 p***7 的大作中提到】
: 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好？ 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。
:
: buffe
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t********e
发帖数: 107 | 30 pH 范围是可以，现在很多柱子都用pure silica bonding，这么低的pH值可以试试有机酸啊。 |
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t**n
发帖数: 4365 | 31 20mM的磷酸盐，最多70%ACN
【在 p***7 的大作中提到】
: 那么用什么比例的ACN 洗柱子比较好？ 真是带感谢了。我觉得就是这个原因。
:
: buffe
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t**n
发帖数: 4365 | 32 SA在C18上保留时间很短
【在 i*n 的大作中提到】
: 你的峰是否出现在ＡＣＮ梯度升到９０％的时候，如果不是，没有必要把梯度弄这么高
: ，如果仅仅是为了洗干净柱子，应该在进下一针之前用无盐低梯度的流动相先洗去柱子
: 里的缓冲盐体系，再改用高梯度的ＡＣＮ洗柱子。
: 如果非要高梯度流动相才能出峰，你可以考虑用甲醇和别的缓冲盐体系，比如甘氨酸缓
: 冲体系，粗略查了一下，也能缓冲到ｐＨ２．６，而且在甲醇里溶解度似乎还行。但是
: 不知道跟你这个分离检测体系有无矛盾，你要自己试试看
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l****o
发帖数: 58 | |
i*n
发帖数: 9793 | 34 用三氟乙酸干吗？
【在 l****o 的大作中提到】
: 为什么不用三氟乙酸？
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p***7
发帖数: 535 | 35 大家有没有改良的mobile phase? 但是我不想再换试剂了，因为没有时间了。
只是想换换梯度。谢谢。 |
