T****i
发帖数: 15191 | |
l*******2
发帖数: 1 | 2 上digital droplet PCR 这个最灵敏
【在 T****i 的大作中提到】
: 千老门大显身手的时候到了。现在50%假阴性。
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x********e
发帖数: 35261 | 3 不是primer的问题。现在都是多基因RT-qPCR了。问题在于病人在不同时期采样不一定
能采到病毒。 |
l*******2
发帖数: 1 | 4 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用
邬旭龙1Δ, 肖璐2Δ, 宋勇5, 林华4, 陈世界4, 杨苗4, 安微4, 姚学萍1,3, 杨泽晓1,
3, 王印1,3
摘要：【目的】 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能导致猪群高死亡
率，从而造成严重的经济损失。因此，建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的
诊断方法以及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而
高灵敏度的ASFV微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)检测方法。【方法】 针
对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和TaqMan探针，通过反应条件优化，建立了ASFV
实时荧光定量PCR (qPCR)和ddPCR检测方法；并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异
性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血
清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的
符合率。【结果】 建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998)，
ddPCR的最低检测限度可达到0.36拷贝，在20 μL反应体系中约为10拷贝/反应，检测灵
敏度是qPCR的10倍。ASFV ddPCR检测方法具有很高的特异性和重复性，不与其他猪常见
病毒发生交叉反应。【结论】 该方法灵敏度高、特异性强，可作为一种有效的分子生
物学方法来诊断ASFV，为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备，同
时促进ddPCR技术在我国的发展和应用。
【在 T****i 的大作中提到】
: 千老门大显身手的时候到了。现在50%假阴性。
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l*******2
发帖数: 1 | 5 Bio-Rad微滴式数字PCR技术（ddPCR）是第三代PCR技术，无需标准参照物质即可给出
样本的拷贝数浓度而非Ct值，其检测结果为判读提供量化的依据。根据LOB(limit of
blank)和未知样本的定量结果作出判读，可避免人为错误，缩小灰区，提高检出率。
ddPCR独有的微滴处理技术，使其对PCR扩增效率的变化不再敏感，不惧含有PCR抑制物
样本的挑战。随着疫情的变化以及流行病学调研的推进，更多类型的检测乃至环境监测
也可能需要进行，ddPCR的这一优势会发挥作用。此外，如果新型冠状病毒发生变异，
病毒基因序列上引物、探针靶向位置出现SNV，ddPCR亦能克服引物、探针结合能力下降
带来的扩增效率变化，确保稳定检出。不仅如此，还能根据样本微滴荧光信号的变化，
发现引物探针靶标区域可能出现变异的病例，为NGS测序分析病毒变异提供样本，助力
流行病学研究。
【在 T****i 的大作中提到】
: 千老门大显身手的时候到了。现在50%假阴性。
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T****i
发帖数: 15191 | 6 谢晓亮的单分子化学能用不？
说起来，谢晓亮海龟的时机挺不好的，正好赶上中国这轮大发展的末期，相当于57年回
国。
【在 x********e 的大作中提到】
: 不是primer的问题。现在都是多基因RT-qPCR了。问题在于病人在不同时期采样不一定
: 能采到病毒。
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l*******2
发帖数: 1 | 7 都告诉你了用ddPCR，你还要顾左右而言它，什么意思？
【在 T****i 的大作中提到】
: 谢晓亮的单分子化学能用不？
: 说起来，谢晓亮海龟的时机挺不好的，正好赶上中国这轮大发展的末期，相当于57年回
: 国。
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p*****o
发帖数: 1 | 8 把你丫开除千老队伍
RT-PCR怎么做假阳性假阴性都高，总之就是各种不稳定。
和操作人和机器和RNA操作间，以及试剂盒都很大关系。就算你用qiagen或者
invitrogen的试剂盒，如果操作的人或者环境烂，也是一个吊样。何况国内那些山寨试
剂盒，你把RNAase抑制剂大把往里整都没用。
用试剂盒检测作为确诊就tmd神经病，只有傻逼猪头在面对这样大规模疫情才想得出来
这种损逼招数 |
p*****o
发帖数: 1 | 9 ddPCR比传统的real time PCR要好点，就是调参数和底峰杂峰方面
但是对起始RNA样品的要求并没有降低，医院那个水平，那么乱，怎么可能弄得的好的
起始检测样本
再说如果用biorad的试剂盒，麻痹tg会被搞破产的，那么多病人，怎么买得起
【在 l*******2 的大作中提到】
: 都告诉你了用ddPCR，你还要顾左右而言它，什么意思？
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l*******2
发帖数: 1 | 10 不是有的时候是真的灵敏度不过，不能和背景ct值分开
这个时候就要上ddPCR,灵敏度直上单分子核酸，有一点儿都能给你查出来，
ddPCR本来就是专门干检测超微量基因突变用的，
现在没有抗体，只能用ddPCR
【在 p*****o 的大作中提到】
: 把你丫开除千老队伍
: RT-PCR怎么做假阳性假阴性都高，总之就是各种不稳定。
: 和操作人和机器和RNA操作间，以及试剂盒都很大关系。就算你用qiagen或者
: invitrogen的试剂盒，如果操作的人或者环境烂，也是一个吊样。何况国内那些山寨试
: 剂盒，你把RNAase抑制剂大把往里整都没用。
: 用试剂盒检测作为确诊就tmd神经病，只有傻逼猪头在面对这样大规模疫情才想得出来
: 这种损逼招数
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T****i
发帖数: 15191 | 11 我也相信你是真千老了。
【在 l*******2 的大作中提到】
: 都告诉你了用ddPCR，你还要顾左右而言它，什么意思？
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m*********9
发帖数: 56 | 12 取样位置在哪里？鼻子？喉咙？吐痰？
美国CDC做的很慢，可能有同样问题 |
l*******2
发帖数: 1 | 13 降低了，可以稀释那些抑制PCR反应因子的浓度，
再没有拿到抗体前，可以先用ddPCR把原来假阴性的样本在复查一遍
【在 p*****o 的大作中提到】
: ddPCR比传统的real time PCR要好点，就是调参数和底峰杂峰方面
: 但是对起始RNA样品的要求并没有降低，医院那个水平，那么乱，怎么可能弄得的好的
: 起始检测样本
: 再说如果用biorad的试剂盒，麻痹tg会被搞破产的，那么多病人，怎么买得起
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p*****o
发帖数: 1 | 14 你是真千老，tianzi越来越像假千老，把丫踢到政屁轮子的队伍里面。
【在 l*******2 的大作中提到】
: 不是有的时候是真的灵敏度不过，不能和背景ct值分开
: 这个时候就要上ddPCR,灵敏度直上单分子核酸，有一点儿都能给你查出来，
: ddPCR本来就是专门干检测超微量基因突变用的，
: 现在没有抗体，只能用ddPCR
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m*********9
发帖数: 56 | 15 你以为一个病人一个样品？
每个病人要取几个样，每个样品要做四个反应。一成积就太多了
【在 l*******2 的大作中提到】
: 降低了，可以稀释那些抑制PCR反应因子的浓度，
: 再没有拿到抗体前，可以先用ddPCR把原来假阴性的样本在复查一遍
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p*****o
发帖数: 1 | 16 钱啊，山寨试剂盒不知道做ddPCR效果怎么样，从来没接触过山寨的，如果用bioRAD试
剂盒，那得多少钱啊。还有real time PCR仪，那得多少钱啊，小地方根本没有，武汉
也不是白菜那样多，小地方如何送样？背着液氮罐跑吗？这个是RNA样品，不是DNA
【在 l*******2 的大作中提到】
: 降低了，可以稀释那些抑制PCR反应因子的浓度，
: 再没有拿到抗体前，可以先用ddPCR把原来假阴性的样本在复查一遍
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l*******2
发帖数: 1 | 17 如果灵敏度不够，你就是四个平行样也没用，
以前假阴性的样品，再用ddPCR再测一遍，如果还是阴性，那就很可能是采集样本出了
问题，如果测出来都是阳性，那就果断放弃传统荧光PCR
【在 m*********9 的大作中提到】
: 你以为一个病人一个样品？
: 每个病人要取几个样，每个样品要做四个反应。一成积就太多了
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m*********9
发帖数: 56 | 18 四个不是平行的。是四个不同位点 （CDC的）
【在 l*******2 的大作中提到】
: 如果灵敏度不够，你就是四个平行样也没用，
: 以前假阴性的样品，再用ddPCR再测一遍，如果还是阴性，那就很可能是采集样本出了
: 问题，如果测出来都是阳性，那就果断放弃传统荧光PCR
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l*******2
发帖数: 1 | 19 那就更应该用ddPCR再测一遍了
【在 m*********9 的大作中提到】
: 四个不是平行的。是四个不同位点 （CDC的）
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l*******2
发帖数: 1 | 20 刘鹤副总理不是刚签了2000亿美元的单子吗，撒开了买Bio-Rad,这才叫钱花到刀刃上，
而且ddPCR很可能能帮助找出那些没有症状却带毒的新冠“伤寒玛丽”
【在 p*****o 的大作中提到】
: 钱啊，山寨试剂盒不知道做ddPCR效果怎么样，从来没接触过山寨的，如果用bioRAD试
: 剂盒，那得多少钱啊。还有real time PCR仪，那得多少钱啊，小地方根本没有，武汉
: 也不是白菜那样多，小地方如何送样？背着液氮罐跑吗？这个是RNA样品，不是DNA
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S*******l
发帖数: 4637 | 21 测什么啊，排除法，已知的病毒panel过一遍，都阴性就是新冠了。 |
z*********a
发帖数: 643 | |
x********e
发帖数: 35261 | 23 统一回复你和某些喷子吧，仔仔细细去NEJM看看美国第一例患者的检测结果。仔细看各
个timepoint的Ct值。你就知道为什么RTPCR做不出来了。
【在 l*******2 的大作中提到】
: 如果灵敏度不够，你就是四个平行样也没用，
: 以前假阴性的样品，再用ddPCR再测一遍，如果还是阴性，那就很可能是采集样本出了
: 问题，如果测出来都是阳性，那就果断放弃传统荧光PCR
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n********g
发帖数: 6504 | 24 秋后算账上法庭的时候，你这句话一定要作为专家证词。
【在 z*********a 的大作中提到】
: 麻痹的，发个R01，哥你想要啥精度都能搞出来
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l*******2
发帖数: 1 | 25 ddPCR 没有问题的，放心吧，只有假阳性，没有假阴性
Digital PCR as a tool to measure HIV persistence
Although antiretroviral therapy is able to suppress HIV replication in
infected patients, the virus persists and rebounds when treatment is stopped
. In order to find a cure that can eradicate the latent reservoir, one must
be able to quantify the persisting virus. Traditionally, HIV persistence
studies have used real-time PCR (qPCR) to measure the viral reservoir
represented by HIV DNA and RNA. Most recently, digital PCR is gaining
popularity as a novel approach to nucleic acid quantification as it allows
for absolute target quantification. Various commercial digital PCR platforms
are nowadays available that implement the principle of digital PCR, of
which Bio-Rad’s QX200 ddPCR is currently the most used platform in HIV
research. Quantification of HIV by digital PCR is proving to be a valuable
improvement over qPCR as it is argued to have a higher robustness to
mismatches between the primers-probe set and heterogeneous HIV, and forfeits
the need for a standard curve, both of which are known to complicate
reliable quantification. However, currently available digital PCR platforms
occasionally struggle with unexplained false-positive partitions, and
reliable segregation between positive and negative droplets remains disputed
. Future developments and advancements of the digital PCR technology are
promising to aid in the accurate quantification and characterization of the
persistent HIV reservoir.
【在 x********e 的大作中提到】
: 统一回复你和某些喷子吧，仔仔细细去NEJM看看美国第一例患者的检测结果。仔细看各
: 个timepoint的Ct值。你就知道为什么RTPCR做不出来了。
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l*******2
发帖数: 1 | 26 等专家评审完，疫情早就结束了
【在 z*********a 的大作中提到】
: 麻痹的，发个R01，哥你想要啥精度都能搞出来
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p*****o
发帖数: 1 | 27 也是，2000亿打包买试剂盒和pcr仪另外再白送一堆千老都够了，买一个pcr仪送一个千
老，试剂盒管够，十万一套
【在 l*******2 的大作中提到】
: 刘鹤副总理不是刚签了2000亿美元的单子吗，撒开了买Bio-Rad,这才叫钱花到刀刃上，
: 而且ddPCR很可能能帮助找出那些没有症状却带毒的新冠“伤寒玛丽”
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l*******2
发帖数: 1 | 28 这些真的花不了多少钱的，这2000亿美元里，据说有800亿美元工业产品定额，中国政
府正在头大要买哪些东西
【在 p*****o 的大作中提到】
: 也是，2000亿打包买试剂盒和pcr仪另外再白送一堆千老都够了，买一个pcr仪送一个千
: 老，试剂盒管够，十万一套
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p*****o
发帖数: 1 | 29 是啊，realtime也就三两万刀，千老价钱也就几万刀一个，所以打包价10万，管够，试
剂盒白送。可以弄好多集装箱回去了 |
l*******2
发帖数: 1 | 30 贩卖人口是违法的
【在 p*****o 的大作中提到】
: 是啊，realtime也就三两万刀，千老价钱也就几万刀一个，所以打包价10万，管够，试
: 剂盒白送。可以弄好多集装箱回去了
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x****6
发帖数: 4339 | 31 你也不关注前沿。。。
你的偶像搞了更牛逼的： Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter
UnLOCKing (SHERLOCK)
能够检测 几百个分子 每毫升 这个量级。
https://science.sciencemag.org/content/356/6336/438
【在 l*******2 的大作中提到】
: 降低了，可以稀释那些抑制PCR反应因子的浓度，
: 再没有拿到抗体前，可以先用ddPCR把原来假阴性的样本在复查一遍
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l*******2
发帖数: 1 | 32 这个属于奇技淫巧，
不如Bio-Rad可以马上大规模部署展开
【在 x****6 的大作中提到】
: 你也不关注前沿。。。
: 你的偶像搞了更牛逼的： Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter
: UnLOCKing (SHERLOCK)
: 能够检测 几百个分子 每毫升 这个量级。
: https://science.sciencemag.org/content/356/6336/438
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x****6
发帖数: 4339 | 33 看原理，make sense
【在 l*******2 的大作中提到】
: 这个属于奇技淫巧，
: 不如Bio-Rad可以马上大规模部署展开
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T****i
发帖数: 15191 | 34 你是假千老。RT之后就放冰上就行了。
【在 p*****o 的大作中提到】
: 钱啊，山寨试剂盒不知道做ddPCR效果怎么样，从来没接触过山寨的，如果用bioRAD试
: 剂盒，那得多少钱啊。还有real time PCR仪，那得多少钱啊，小地方根本没有，武汉
: 也不是白菜那样多，小地方如何送样？背着液氮罐跑吗？这个是RNA样品，不是DNA
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