s******y
发帖数: 28562 | 1 正常，因为有些细胞出现了分裂障碍。
多分几代，分到大概7~8代的时候，那些乱七八糟的细胞就因为不能正常分裂而死光了。 |
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m***g
发帖数: 197 | 2 我也正好有各相关的问题，一直困扰着。
问别的试验室要了一对MEF （wt和ko的），我想immortalize它，因为以后想经常用到
。我就打算一直传。
问题是，那个细胞长的特别慢，有的细胞拉伸的特别长，而且经常有死细胞悬浮。我只
好2天换一次DMEM（+FBS）。因为细胞数目越养越少，现在从要来之后从一个大flask传
到小flask，细胞密度与日俱减，真担心再过几个星期就养死了！
有没有什么挽救的办法？谢谢。我就这么“不管不顾”的传，可以么？需要额外添加的
什么东西能让细胞长的happy点么？ |
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a****c
发帖数: 339 | 3 我用primary MEF,理论上只用passage 5之前的，根据实际情况有时候p6也能用，有时
候p3看着就完了。
有些实验室用T-antigen 做immortalization。不过我们老板死活不让用，非常郁闷。 |
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h******y
发帖数: 351 | 4 sv40 T will inhibit p53, so it can be used to immortalize MEF
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h******y
发帖数: 351 | 5 What do you want to do with the MEFs? Can you elaborate more
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s******s
发帖数: 13035 | 6 印象里会小鼠细胞会自发delete某一段chromosome, 然后immortalize。
记得就小鼠这样。human啥的可能要bypass两个通路，所以很少 |
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D*a
发帖数: 6830 | 7 非要用immortalized细胞么？你把一到2代的细胞冻起来，慢慢用不行么？ |
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h******y
发帖数: 351 | 8 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
也已经不能作为参照了。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 9 听起来好生动啊，ROS这么牛，MEF这么菜
MEF
建立 |
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l****j
发帖数: 70 | 10 我是分别从wt和ko mouse embryo 中分离的MEF cell,不是用来做feeder，
敲除的基因能在 ER stress，apoptosis，autophagy 中起作用，
我有overexpression的细胞系，但还想用MEF cell 做类似的实验，其他人发表的文章
用过MEF cell，我也想试试。 |
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l****j
发帖数: 70 | 11 低氧的环境下会不会对我要研究的蛋白质有影响？
MEF
建立 |
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l****j
发帖数: 70 | 12 我确实想要长久使用MEF,
请问新鲜的MEF是指在20% 氧气吗？可以最多传几代？
如果是低氧能传到第几代呢？能一直养下去吗？
如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
5%）条件培养MEF。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 你说的这些道理大家都明白，但是没有任何一个实验系统是完美的。
对于用immortalized细胞系做的实验，关键就是要做rescue实验进行对照，
在此前提下（有正确对照）做出来的结果还是能够得到认可的，很多文章
就是这么发表的。
其他方法，包括RNA knockdown, or molecular inhibitors, 都各有各的缺陷，
并不一定就比这个好。所以比较严谨的文章会同时用几种方法来重复
一些关键试验。 |
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w***a
发帖数: 1053 | 15 我见过有人加一些生长因子
长的很好
就是那些东西都比较贵 |
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h******y
发帖数: 351 | 16 If you culture MEF under 20% oxygen, then it is the best to use cells before
passage 6 (please keep in mind that the best seeding density of MEF is
about 5000/cm2.)
If you culture the MEFs under 3-5% Oxygen, you can go up to 50 passages.
Huge difference as you can see.
3-
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
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h******y
发帖数: 351 | 17 In your case, I think you might want to try different protocol. A good
protocol should yield nice MEF culture from the wildtype embryo at least.
The most important thing is to avoid overdigestion with trypsin, which will
always leads to poor culture.
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h******y
发帖数: 351 | 18 Good point.
This is exactly right.
LZ need to think about other experiments that can corroborate any findings
from this paired immortalization experiment.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 对了，你有没有最新的比较温和而成功率又比较高的immortalization MEF的方法？
我们合作者那里有一个新的cell line, 他们用3T3 protocol 试图了好几次都没有
成功。现在我实在是等不及了，打算自己来诱导，但是既然他们没有成功，可能
我们也不一定能成功。
findings |
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l****j
发帖数: 70 | 21 我follow的protocol说，b-ME 是为了创造一个还原条件，防止细胞分化。 |
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l****j
发帖数: 70 | 22 我见过有人就用的wt MEF 然后转染shRNA做成KO,但是只有80%左右ko了。
findings |
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h******y
发帖数: 351 | 24 你说的比较温和是指什么？
来源于很多组织的人的fibroblast可以通过overexpress hTERT得到immortalization，
这是由于人的fibroblast在体外培养条件下的senescence多是由于端粒渐行缩短而导致
的（telomere-dependent replicative senescence）。与人的fibroblast不同，体外
培养中MEF的senescence并不是由于端粒缩短引起的,而是由于如前所述的过氧基团累积
oxidative stress induced DNA damage。研究表明senescence的MEF的端粒还很长，而
且MEF中有较高的mTERT表达，所以过表达mTERT并不能有效immortalize MEF。因为要抑
制p53和Rb通路，所以表达异源的SV40 T和HPV16 E6/E7都可以immortalize MEF。当然
这样得到的细胞株，由于这些病毒蛋白的过量表达，基因组并不稳定，长久培养会出现
嬗变。
3T3办法引起的自发immortalization实际上主要是由于自发的p53通路抑制（p53 loss... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 谢谢！我的合作者就是用的你贴的3T3方法，但是他们没有弄出来。
我以前也用过3T3方法但是那个是野生型，很容易诱导的。
现在这个KO, 说不定就是如你所言和p53和Rb通路有间接关系，
我为了保险，想用其他方法来诱导，不知道除了用病毒，还有什么其他法子么？
比方说加个什么什么化学品之类的？
如果用病毒的话，是否要用lenti or retro vector? |
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h******y
发帖数: 351 | 26 对于上皮细胞，最近有人发现利用feeder cells（主要是MEFs）和ROCK Inhibitor可以
有效immortalize。但是对于MEFs，光用ROCK Inhibitor可能不行。除了常用的SV40T和
HPV16 E6/E7，也可以用其他oncogene，例如c-Myc，Ras，BmiI，CDK4等等。因为MEFs
是原代细胞，转染效率很低，通常大家都用lenti，retro，或者电转。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 好的。谢谢！
我先去查查文献。如果还是不明白再来问你吧：）
MEFs |
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g****0
发帖数: 425 | 28 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
-6盘10cm板，有何不妥吗？ |
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h******y
发帖数: 351 | 29 一个embyro出3-6个10cm的板？厉害，下次用你的办法试试。
张3 |
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g****0
发帖数: 425 | 30 先切碎，再泡。都要冰凉的。过夜还有一个好处就是可以先拿到genotyping结果。
你试试，然后对比一下，看MEFcell有何不同。 |
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y***y
发帖数: 709 | 31 这个太强大了！
比我的产量高出4-6倍。
张3 |
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h******y
发帖数: 351 | 34 MEF would grow faster in 3% O2 than in 20% O2. Maybe you can try different
seeding and subculture schedule? |
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a******7
发帖数: 7936 | 36 是啊，培养液中为什么加b-ME啊，这玩意不是做western的时候用来保持蛋白完整性的
么？跟二硫键有关 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 38 thanks, how much about this? |
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h******y
发帖数: 351 | 39 I am not sure how much we paid for this model. You may need to get a quote
from the manufacturer or distributor. |
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b*****n
发帖数: 1841 | 40 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 41 楼主，请问你用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系是怎么操作的？
细胞染毒后稀释传代加药挑单克隆？还是只是加药筛选后pool所有的存活细胞？ |
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l****j
发帖数: 70 | 42 用的1mg/ml G418筛选的稳定转染细胞，在后续的传代培养过程中，还要持续加低浓度
的G418吗？比如100ug/ml,10ug/ml, or 1ug/ml? |
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t****p
发帖数: 1504 | 43 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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t****p
发帖数: 1504 | 44 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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u**********d
发帖数: 573 | 45 正如楼上们所说，要拿到-/-的细胞，可靠的方法就是两轮转染筛选，这还是一个费时
费力的活的。还没有用过talen系统。
ES细胞系在传代过程中会因为压力小逐渐含有一些genome的变异，包括染色体的
deletion，translocation和aneuploid非整倍体，而两轮的克隆筛选很可能会得到一个
不正常的ES系，光做核型分析还是不够的。
希望KO是ES表型变化的唯一原因，必须rescue实验。
很多KO可能对ES的维持是没太多影响的，起作用是在分化阶段，要用in vitro方法分析
就需要建立不同的分化体系。
用+/- 老鼠配对就反而显得简单了，得到的ICM基本都是没有大的genome缺陷的，-/-的
表型也很好观测了。 |
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T****O
发帖数: 407 | 46 延缓衰老和长寿对于大型哺乳动物有一个至关重要的意义：保证生存技能的传代。
这完全不能通过遗传完成。一个种群获得新的、复杂生存技能非常不容易，需要长期观
察、模仿和反复训练。 |
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c*******0
发帖数: 190 | 47 跳出“人”的概念想一想。。。大部分癌症病人死于多器官衰竭，这也正说明了“人”
作为宿主机体的脆弱性。。。但作为这一部分“癌细胞”，或者是我们实验室里常用的
癌细胞系，有没有想过如果提供适当的生存环境，一千次、一万次甚至一亿次传代后是
否会自组织形成更高等的生命形式？而这种新的“生命形式”也许会比延正常轨迹进化
的“人”更牛X？
好吧，这些想法来自被王晋康的科幻小说“50万年后的超级男人”以及生化危机的T病
毒游戏设定。。。供大家当笑话看了。 |
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p*****u
发帖数: 191 | 48 乙肝，国病，在过去里程碑式的研究发现中没有一个源于国内科学家的发现，无论
是病原发现、基因克隆、还是疫苗开发、或者治疗性的药物。北生所的李文辉课题组发
现乙肝新受体：NCTP基因，这个是一个有意义的研究，但是这个研究是里程碑式的发现
吗？是独一无二的开创，还是众多研究发现中的其中一员，新浪微博上有一位传染病专
家这样评论“一篇文章而已”。
从临床和疾病控制角度来说，控制乙肝的关键依然是提高疫苗接种的覆盖程度，这
是对群体最有效的方法，更多的精力和物力应该集中到提高疫苗保护率，降低疫苗失败
的研究原因中去。对于现症的慢乙肝患者，更重要的是提高医保的覆盖面积，让更多病
人有条件接受规范的、长疗程的抗病毒治疗。对于肝硬化和肝癌的患者，更重要的采用
综合的治疗措施，主要是外科方法来延长生命。正如10年前出现的SARS，传染病隔离措
施的重要性远远超越病原学研究。这些是大范围的政府和政策行为，卫生部的最大的工
作目标就是让每人每年享有300元的卫生服务。
饶毅教授近期对乙肝的研究进展进行了非常好的描述，饶教授列举了乙肝里程碑的
发现、列举了国内科学家在乙肝动物模型研究中的重... 阅读全帖 |
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y********g
发帖数: 782 | 49 Treat的细胞也是这样子的，好像细胞“漏”了似的~~~
细胞悬浮了会是这样子的吗？悬浮细胞一般都是圆的吧，我的看起来好像还贴壁。
用同一个incubator的女生的细胞没有问题，我Flask里面传代的细胞也没有问题。哎，
纠结死了。。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 50 就实验研究手段而言，两者有啥区别？
satellite cell可以认为是muscle stem cell，我看到paper上大部分都是小鼠in vivo
的实验。primary myoblast实际上也是将satellite cell传代分离得到的。那么，假如
体外培养muscle stem cell，不就变成了myoblast?
谢谢！ |
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