l*******i
发帖数: 153 | 1 我试了三次，只有一次，得到唯一一个human ES-like的colony，但是传代两次后就分
化了。
那篇文章号称的10%的诱导效率，不知他们怎么算的？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 2 端粒酶缺失的老鼠要传三到六代才能显现出早衰和寿命缩短的现象,几篇关于端粒酶和
小鼠寿命的CNS文章都是用得其他原因早衰小鼠或者第五六代的端粒酶KO小鼠,人里面端
粒酶缺失似乎跟寿命和早衰有关,但是原因貌似不是很明确.
端粒缩短也可能是一种保护机制,为了让那些传代了n次的细胞的各种错误不至于癌变(
忘了哪个ref里看的了,忘了是假说还是什么了). |
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a******n
发帖数: 392 | 3 因为人胚胎干细胞解离成单细胞后会分化或者死亡，所以一般细胞传代时是不用
trypsin的。这时人和鼠干细胞不同的地方。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 4 小分子诱导iPS，我们也做过，对于p53-/-的fibroblast,比较容易，可以得到不少
colony；但是，对于wt fibroblast(OG2,就是邓宏魁文章中用的)，持续诱导5-8周，才
能得到几个GFP-positive的colony。但是不幸的是，这两种fibroblast诱导来的iPS都
不能维持self-renewal很长时间，一般地，传代几次，就会分化，失去其干性。
当然，邓用的小分子化合物cocktail和我们的有些区别，可能原因就在这里。
这种方法安全性到底如何，还有许多问题要回答。由于所用的小分子化合物中，有些与
表观遗传修饰酶有关，一个自然而然的问题就是：小分子化合物诱导的iPS的epigenome
与ES和/或TF诱导的iPS，差别有多大？ |
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P******r
发帖数: 966 | 5 生物学实验靠实验室内部帮传代就差不多了，多走不了多少弯路。
在大牛实验室更可能扩大眼界，跟牛人共事能看到牛人的做事风格，能建立业内
connection，这些东西不是老板带带做一些实验室能够弥补的。
ph.d选ap博后选牛人，这种论调可以休了。 |
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m********o
发帖数: 13 | 6 嗯，是同一支tube里的plasmid。要转的是一个细菌蛋白，如果有毒的话会影响转染效
率吗？但是细胞形态看起来都不错，也没什么漂浮的细胞。准备拿GFP vector再试一次
。不知道是不是因为HELA传代太多的原因？还有如果普通显微镜看不到荧光的话，
western有没有可能看到表达？问题太多了，谢谢大牛先~ |
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b********e
发帖数: 50 | 7 做iPS一般用原代细胞，体外最多可以传代50次？ 表达3个基因的话，可能还没有做成
stable cell line，细胞就死翘翘了。做过iPS的同学建议一下呗。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 8 现在在用HUVEC细胞做实验，这细胞长得很慢，但是我做实验需要很多细胞，更重要的
是这个细胞只能用2-4代做实验，传的代数多了以后至少形态上就变化了。
1) 冻村的细胞可否看作passage 0？
2) 复苏到dish里开始培养的细胞看作 p1？
3) 每传一代，trypsin处理一次，代数增加 1？那么对于suspension 细胞怎么算第几
代？
4) 比如我把细胞养到第10代了，然后冻起来了，再复苏，算p0 还是p10？
5) 为了能用低代数细胞做实验，可不可以传代时候细胞密度适当低一点多分几个dish
，这样就有足够的低代数细胞做实验了？
问题可能比较菜，请大家帮我澄清这个问题。网上google的结果大家似乎说法都不一样。
谢谢了！ |
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w***r
发帖数: 709 | 9 4) 比如我把细胞养到第10代了，然后冻起来了，再复苏，算p0 还是p10？
still p10 because liquid N2 is not foundtain of youth, and cannot restore
the cell state.
5) 为了能用低代数细胞做实验，可不可以传代时候细胞密度适当低一点多分几个dish
，这样就有足够的低代数细胞做实验了？
No,passage number is used to estimate the cell doubling cycles.
dish
样。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 10 自从ZFN（后来的TALEN, CRISPR)开始应用以来，大家一直在找一种好的办法做基因敲
进。以大鼠为例，如果没有一系列的CRE工具鼠，大家就不会去做条件性基因敲除。但
除了小片段（或ODN)以外，大片段的基因敲进一直没有成功的报道。
这几年我自己也一直在想如何能够在这方面做点事情。做公司跟做科研不一样。科研实
验室里对效率不是很关心。比如可以通过注射几百上千的受精卵，最后只要有成功的就
算成功，然后发文章。而做公司更关心的是技术的稳定性，也就是除了高效率，还要重
复性好。所以我们就组建了一个研发团队，专门做大鼠的基因敲进研究。
经过一年多的摸索，最后终于找到了一种通过受精卵注射做基因敲进的方法。这个方法
的原理是通过利用ZFN/TALEN/或CRISPR先在染色体上切一刀，然后让带有同源臂的打靶
载体在切割位点进行同源重组。我们先在细胞系上进行摸索，最后得到了一个很有效的
基因组编辑系统。然后我们就看这个系统是不是可以在大鼠上用。因为信心比较大，我
们就直接进行双基因敲进实验了。分别是在大鼠CD4基因后面加上DsRed，在FoxP3后面
加上 IRES-DTR-2A-EGFP-p... 阅读全帖 |
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z****u
发帖数: 1007 | 11 Mx1-Cre是个inducible cre line. 需要interefon 诱导才有cre 活性。 理论讲homo是
正常的无phenotype. 所以一般来说你可以直接generate Mx1-Cre; flox/flox line,
并用其传代，这样比例高很多。 |
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d*****r
发帖数: 45 | 12 这个kit应该是买一次可以一直用吧？
看manual上写的，它带的plasmid vectors可以sbuclone，aav-293细胞可以传代。
但是它说 "pRC and pHelper plasmids are sufficient for two transfections " ，
不会是这两个不能扩增吧？
有没有用过的高人给讲一下？多谢！
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H****s
发帖数: 301 | 13 往细菌里转了一个基因文库，发现了一个表型改变。似乎这个表型变化是不可逆的，挠
头中。我更感兴趣的是细菌的这个新表型。请问有没有什么办法去掉细菌里转进去的质
粒？这个质粒是基于pUC Ori的，是个高拷贝质粒。如果我在没有抗性的培养液中连续
传代，会不会彻底除去？谢谢。 |
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V******t
发帖数: 444 | 14 如果一个实验室配齐下列仪器 就是天堂了
miniprep质粒 Qiagen的cube 能自动提质粒
western： 自动洗膜换液机
qPCR： 96孔板自动加样机
细胞计数：细胞自动计数仪
co－IP：自动加抗体洗beads仪
除了分细胞传代好像还不能自动化吧？
电动连续加样枪 电动排枪
然后所有sds gel都买预制的， 养细菌的agar plate、LB， 各种running buffer都有
技术员配好
老鼠genotyping有技术员做
各种buffer都买商用的
省下来的时间喝咖啡灌水逛街，当个千老也不是那么难过的事情了吧 |
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i*****i
发帖数: 154 | 15 commercial的competent cell太贵了，想自己做一些。
把买来的competent cell 摇起来一些，然后做competent cell，但是效率似乎非常的
低，不知道版上有没有人有过类似的经验。我之前一直自己做competent cell （不同
菌株），效率非常非常的高。
是不是要传代几次啊？ |
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b****r
发帖数: 17995 | 16
懂得不多，只是提提个人观点
其实你们两个人 说的是对的
你可能看过RP Lifton的papers。他一直致力于 研究 rare mendelian diseases。 他
目前和BCM,Wash U@SL 和 JHU 一起在做 mendelian genetics consortium。 通过在
全世界找 “extreme phenotype - disease outliers” 和 “inbred family的疾病”
来寻找 human knockout的phenotype。
通过 RP Lifton的实验，你发现，这个世界上 仍然有很多 monogenic的病。 但是从
临床的角度来考虑， 研究 monogenic的疾病 究竟有治疗价值吗？ 1/100,000 的
mutation导致的 rare disease, 有哪个药厂会愿意生产药物来治疗呢？ 所以，工业圈
自然也不会对这个领域感兴趣...
--你不能把眼球停留在眼前，应该放眼10年以后，你职业生涯的成熟期。100，000人一
例患者，全世界有多少患者？数十万！测序技术的普及以及互联网，在几年后就会把这
几十万人基本... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 17
懂得不多，只是提提个人观点
其实你们两个人 说的是对的
你可能看过RP Lifton的papers。他一直致力于 研究 rare mendelian diseases。 他
目前和BCM,Wash U@SL 和 JHU 一起在做 mendelian genetics consortium。 通过在
全世界找 “extreme phenotype - disease outliers” 和 “inbred family的疾病”
来寻找 human knockout的phenotype。
通过 RP Lifton的实验，你发现，这个世界上 仍然有很多 monogenic的病。 但是从
临床的角度来考虑， 研究 monogenic的疾病 究竟有治疗价值吗？ 1/100,000 的
mutation导致的 rare disease, 有哪个药厂会愿意生产药物来治疗呢？ 所以，工业圈
自然也不会对这个领域感兴趣...
--你不能把眼球停留在眼前，应该放眼10年以后，你职业生涯的成熟期。100，000人一
例患者，全世界有多少患者？数十万！测序技术的普及以及互联网，在几年后就会把这
几十万人基本... 阅读全帖 |
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Q*****G
发帖数: 638 | 18 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
胞分选么？
通常转染后多久细胞分选?
是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
谢谢 |
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r******k
发帖数: 446 | 19 最近小弟要culture K562. 以前没杨过悬浮的细胞。大神们给点意见？
1. 复苏以后怎么又贴壁细胞？？？
2. 怎么传代呀。。。离心下来数细胞数？ 那传到25cm dish 和T75的dish都需要seed
多少细胞？ 多久算养好？
谢谢 |
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a**********3
发帖数: 86 | 20 各位大牛，请问flushing out和离心分离两种方法哪种更好？我看文献有冲洗分离好像
是常规的方法，但为了方便想采取离心分离出骨髓，不知道这种方法好不好，请有经验
者不吝赐教。另外，一个wistar鼠的两个股骨提取出来的细胞数够不够？想放在100mm
dish里养着传代 |
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发帖数: 1 | 21 最近genotype一个cancer cell line（neuroblastoma）的microsatellite （tandem
repeat）位点
大概三个月前测的是这个位点是homozygous有6个repeat
然后最近重新解冻另外一个stock，start cell culture，测量同样的位点，居然成了
heterozygous，一半仍然6个repeat，另外一半成了10个repeat；反复做了很多遍，换
了所有的reagent生怕是contamination，但结果还是一样。
问了lab technitian，这个neuroblastoma在我们实验室都是一样的来源，他也怀疑这
个repeat是不是dynamics的
三个月前的cell line的passage不记得了
最近这个cell line的passage大概是p10
我想问下，cancer cell line的genome microsatellite难道真的会传代传着传着就发
生了变化？如此不稳定？ |
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f*****f
发帖数: 195 | 22 microsatellite不了解。但很多cancer cell line并不是完全homogeneous的，而且自
身的genome instability 在传代过程中也会导致异质化。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 23 以前很多把human cancer cell line直接移植到nude mice，但最近看到好多做cancer
的对xenograft模型诟病很多。比如cell line传代次数很多已经无法估计，缺乏免疫反
应，缺乏肿瘤微环境等等。假如现在想拿xenograft肿瘤模型作高通量筛选，是不是已
经不是一个好的实验设计了？大家可以进来谈谈看法？ |
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f*******e
发帖数: 354 | 24 不要用mscv，cmv这些常规retrovirus的promoter，很快会被silence，可以用plenti，
psin，phage等，ef1a, cag, pgk可以坚持一段时间，但是也存在被silence等现象.转
质粒总体比较困难，病毒是最高效的方法。在细胞传代的同时加lentivirus，
polybrene，然后spin半小时，效率会很高. rock inhibitor记得加，不然细胞会死光
光.病毒含血清的话几个小时后就可以换掉，如果要drug selection，过夜也没事，第
二天可以继续加rock inhibitor，浓度可以降到5um。
good luck！
: 非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些
: transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！
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发帖数: 1 | 25 非常感谢。我用的pCDH是EF1a promoter，就是越往后传代，colonies数量越少。我把
细胞一直养在含puro的hESC media里。非常感谢你的帮助。 |
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s*****n
发帖数: 94 | 26 星期五传代（feeder free），星期六可以不去，然后星期天早点换培养基。 |
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d**********9
发帖数: 981 | 27 那不是刚传代的细胞，可不可以周五傍晚换液后，周六不换，周日早上换？
实验室只有我一个人做，没人跟我轮 |
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j*******1
发帖数: 266 | 28 过渡化石在哪里？ 这个问题一直是支持和反对达尔文理论争论的热点。 在进化论和神
创论信仰辩论中，这是个争论不休的话题。 辩论的人似乎认为如果能找到很多 “过渡
化石”，达尔文理论就是对的，这种想法是一个误解。 “过渡化石”只能告知人们在
已知的物种之间可能还有一种或几种未知的物种， 根本不能说明这些化石代表的物种
是如何产生的，而达尔文理论是物种如何产生的理论。
人们总是要回到现实中来。 人们发现化石都不连续的， 所谓 “过渡化石”即使有，
也很稀少。 这一点在支持达尔文理论和反对达尔文理论的人中争论都不大。
首先要指出的是过渡化石在哪里是个不恰当的问题，它背后的含义是 有大量的"过渡
化石"，它们是在那里？ 它更的深层含义是达尔文理论和一切物种渐生理论是正确的
。 而正确的问题是“化石是否应该是连续的”或是否应该有大量的"过渡化石"？
只有在包括达尔文理论和其它物种渐生理论正确的情况下， 才会有大量所谓的“过渡
化石”，它们才有可能被最终发现。 但地理学家经过多年的苦苦探索，只发现很少的
“过渡化石”。 达尔本人也认识到这一点。 他写道： “以前形成的中间体的数量应
是非常... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 29 我成功过，不过是那种一直单细胞传代的干细胞，经典的干细胞adapted过后的
Subclone里成功了。 |
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发帖数: 1 | 30 作为曾经的千老，我一般清高地都不会回帖。我现在不是千老了，看着这熟悉的、却总
是悲伤的故事，来说一下。
生物这个行业与其他行业一样，每一个人的成功都很大程度上取决于外在条件：你碰到
了一个牛逼的老板，你还碰到了一个牛逼的课题，你的课题还不需要特殊的实验方法,
老板对你的课题还感兴趣花了一切力量让这个文章发在一个牛逼的杂志上。于是，你的
大文章有了。你错误地认为，这是你的能耐，但实际上很多情况下，这其实就是个运气
，就像细胞传代时，20%的细胞幸运地留在盘子里，80%的就这么被扔掉，无论你多么优
秀！
可是，生物与别的行业不一样，因为它几乎没有实际产出，所以你所有的努力能带给你
切实所需的东西太少。平均水平下，一个薄后的工资+福利是7万，3年发个可有可无的
JBC。请问什么样的国家可以富裕到随便扔个20万美金投入到几乎有回报的产业中去？
生物基础科研会萎缩，无论在哪个国家都是这样，现在已经萎缩，将来更会！
每个行业的人都很清高，外行的人嘲笑生物，生物也嘲笑外行，这是自然，但是生物这
个行业的人更容易嘲笑外行，因为生物的收入更低，前途更渺茫。所有的这些压力逼得
生物人以各种借口去稳定自己心... 阅读全帖 |
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R*****w
发帖数: 8634 | 31 呵呵
http://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%90%AC%E5%8F%A4%E9%BB%B4%E7%B4%
万古霉素首先被 EC Kornfeld（礼来公司员工）从一个传教士采集的婆罗洲丛林深处的
土壤中分离出来。产生万古霉素的细菌最终被命名为东方拟无枝酸菌。使用万古霉素的
最初目的是治疗由耐青黴素的金黄色葡萄球菌引起的感染。
最初，这种分离出来的化合物被简单的标记为05865，但是最后它有了一个通用的名称
：Vancomycin（从单词 "vanquished" (征服)衍生而来）。很快，万古霉素的优点就表
现了出来：尽管在含万古霉素的培养基上经过多代的传代培养，葡萄球菌仍然未显示出
明显的抗药性。当时，越来越多的葡萄球菌对青霉素类抗生素产生了抗药性，这使万古
霉素很快在1958年获得了FDA的许可。Eli Lily公司首先生产并销售万古霉素，商标是
Vancocin。 |
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w********h
发帖数: 12367 | 32 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: toptip (土翁), 信区: Biology
标 题: 从整型医生到诺贝尔奖-山中伸弥的研究历程
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Oct 17 00:04:30 2012, 美东)
引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳... 阅读全帖 |
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j***b
发帖数: 5901 | 33 "那么下一个自然的问题是： 这个新得到偶数染色体的新种是如何传代下去？根据种的生物学定义，它是不能与原种交配生出有生育能力的后代的，猴是不可能于人交配生出有生育能力半人半猴的。"
This is wrong. The 新得到偶数染色体的 individual may not be a 新种. It may still produce viable offspring with other individuals with different number of 染色体. The number of 染色体 isn't the whole story. The structure is also important.
For example, the first human who had 46 chromosome could produce offspring of 47 chromosome. For these first generation offspring, they had sperms or eggs of either 23 or 24 chromosome. De |
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a*******1
发帖数: 8 | 34 你好！我目前主要做Stress对Synaptogensis & synaptic transmission的影响和机制
，focus on一种神经肽及其受体家族在其中的作用。Hippocampus是我最关注的脑区。
掌握的技术主要有：
1、细胞培养：原代如海马神经元，传代的如PC12。
2、ICC/IF，IHC/IF。
3、行为学实验：open-field，Morris水迷宫和Y迷宫。
4、分子技术：western blot，PCR，plasmid的转化和转染。
5、电生理：入门级，会切脑片和whole-cell patch，记录过AP、EPSC和fEPSP。
6、软件：Premer Premier、ImageJ、IPP、SPSS等，Metamorph和Matlab正在学习。
本科时做过一点点生物信息学，关于不同物种的密码子使用偏好。
请多指教！ |
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m*******r
发帖数: 7495 | 35 中国现代女性,受毛时代影响还是深远的，虽然已经传代了 呵呵
对于housewife这个概念，瞻前顾后的惊恐感，不说人人有，还有蛮多不同程度有 |
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m*******r
发帖数: 7495 | 36 ☆─────────────────────────────────────☆
Avantgarde (911) 于 (Thu Jan 20 17:40:41 2011, 美东) 提到:
作为一个女人，个人以为在瑞士，首先的任务是如何做一个好妈妈，然后才会去考虑学
位阿什么的。
我，19岁来到欧洲，开始是读书，还是上数学系的（当时在德国学语言，在德国申请大
学），后来晃来晃去来到了瑞士，认识了现在的先生，当时他已经工科博士毕业，后来
就是结婚有了孩子，主动放弃了在读的diploma，专心做一个家庭主妇和文青妈妈，感
觉挺好的。在孩子不需要很多时间的时候，再去大学里旁听自己喜欢的东西。也曾想过
是否再次回去继续读diploma，后来想想，还是放弃了。因为我毕竟没有什么上进心来
着。
我经常想，是做一个女博士后，在学业上在研究上苦苦打拼的女博士后快乐，还是做一
个简单的hausfrau，会做很好吃的菜，空闲的时候和先生一起去看演唱会或者歌剧，
把家里打理得漂漂亮亮的，孩子也很健康成长的hausfrau更快乐呢。
如果要我选择，我选后者。如果要我再次回到我的20岁那个时候，我还是会... 阅读全帖 |
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e****g
发帖数: 4534 | 37 被他老婆坑了，在微博上骂“没有礼貌的中国人”，还上了人家照片，最后证明乌龙了。
连我都跟着中枪，那天一大早就有人@我，让我偶像管管他老婆。。。。我。。我要是
有这能耐，早让他离婚娶我了。。。。那女的。。。只能说一句：丑人多作怪。
于是有些“粉丝”出来吐槽他演唱会如何高贵冷艳，国语歌太少，看不起大陆人，没跟
台下观众好好互动云云。要是他们听过香港的DUO，因为台下观众乱喊乱叫，被小胖叫
“野人”，还改到歌词里，那是不是代表胖子也看不起香港人啊？某些fq就是玻璃心
，神马事儿都得扯上地域，自轻自贱。最可笑是墙倒众人推，连他爸当初贪污都给拿出
来批斗，还有让他给大家下跪认错的。。。“中国人”文化大革命的精神都传代了。 |
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c*****r
发帖数: 1476 | 38 我头像里这种档次的表是日常佩戴型的，对版上工作的人都是毛毛雨而已。
人家玩表的都是50K-500K+ usd 搞一块百达，郎格或者江诗锁在保险柜里，隔三差五用
winder摇一下让它不要停。这种表一般都是传代的，碰到子孙不肖的卖出去了比黄金还
保值。 |
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t******e
发帖数: 365 | 39 我可没说..
这么好的一个小爸爸, 不用太浪费了..
这么好的基因, 不传代太可惜了..
亲妈你要相信科学技术哈... |
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m*******e
发帖数: 21667 | 40 国策研究所国家安保战略研究所责任研究员李基东28日表示：“可以感觉到，北韩核心
领导层正在进行有关继承问题的某种讨论。”
李基东在北韩专家运营的网站“北韩频道”的刊载文章中表示：“最近在北韩的官方文
献中发现了有趣的内容。”同时发表了上述言论。
他表示，北韩最近正在宣传金日成主席和金正日委员长10多岁时的英雄之谈，并表示：
“这强调了年龄对于搞革命来说并不那么重要。”也就是说，北韩考虑到了金正日的儿
子分别是36岁（金正男）、26岁（金正哲）、24岁（金正云）。
李基东表示，上月16日金正日65岁生日时以主要权力机构的名义发表的“贺词”中使用
了“传代”一词等，从去年就开始出现这个措辞，应该对这一点予以关注。据说，原来
北韩一直只使用“革命的首脑是金正日同志”的措辞。李基东预测说，为了使条件更加
成熟，继承构图可能会推迟5年以上才能初现轮廓。
另外，还有人分析说，金正日正在准备以军方为中心的集团领导体制。韩联社最近援引
中国消息人士的话报道说：“原来将长子金正男选为继承人，但由于情况恶化，所以改
变了方针。目前已经开始试运行。”最近，奥地利维也纳大学的北韩专家卢迪格-佛兰克
教授也表示 |
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m**i
发帖数: 724 | 41 反正现在我不喜欢他了,
觉得他太多的电影技巧,
忘记了电影本身应该传代的精神.
时
见 |
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