o******d
发帖数: 204 | 1 说到最后一点，其实对学生也不是坏事，刚发现这篇Cell的一个第一作者这是去年那篇
Nature Immunology的第一作者，在国内岂不是发大了？
他确实挺出色的。
06年回国，09年还是10年已经有了国内得pnas和自然免疫。
当然cell总是表示上了一个层次。
但是也不算特别惊讶，因为
（1）人家博后老板是beutler啊，大牛。文章送审不会被整太惨。
（2）免疫学科：从大牛实验室出来独立发文来看免疫得档次是最高的，从发育，神经
顶级大牛实验室出来很多发过cns得博后出来自己独立头5年一般就是10分以下水准，
developement,JNI，能发cell子刊级别得已经非常牛。独立5年内就能发cns或者nature
子刊得别说国内，国外top得ap
也很难。
然而免疫出来的几乎每个独立后都很快能发很好的文章。
参见flavel最近出来的中国博后，li ming (mskcc), chi hongbo(st jude), wan
yisong(nuc)，几乎都是3年内就有immunity或者自然免疫出炉。同等比较做发育（
elaine fuchs，schier为例），细胞（xia... 阅读全帖 |
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r**a
发帖数: 121 | 2 最近在做组织的FACS，用Trypsin和collagenase处理
我用的是10X Trypsin EDTA，后来发现EDTA是Trypsin和collagenase的抑制剂
Trypsin Inhibitors:
* Pancreatic-, soybean-, lima bean-, and egg white- trypsin inhibitors (
see section on Trypsin Inhibitors)
* DFP
* Aprotinin
* Ag+
* Benzamidine
* EDTA
Collagenase Inhibitors:
* EDTA, EGTA
* Cysteine, histidine
* DTT
* 2-mercaptoethanol
* o-phenanthroline
* Hg2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+
* Not inhibited by DFP or serum
(White and White ... 阅读全帖 |
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f*******a
发帖数: 671 | 3 有一片综述，上面有一个list, 我记得最亮的是PE(488).APC(633)也是最亮的之一。
如果只用两种颜色，我就用这两个，因为不需要做compensation.死细胞可以用DAPI 但
是PE, APC不适合在显微镜下面看，因为photobleach很快。但是非常适合于流式，因为
信噪比高。
如果是3种颜色我会再选A594或者A555,因为激发光不同，不需要compensation.
因为compensation永远都会导致信号的损失。
另外还看看你们实验室的仪器是不是有这么多laser. |
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R***R
发帖数: 166 | 4 我感觉是用流式筛选过后，细胞微环境发生的变化对基因表达的影响更大。你说的那个
仅仅是保证RNA不讲解。
个人意见。 |
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p********e
发帖数: 61 | 5 兄弟是想做什么样的抗体? 多抗？单抗? 多抗多为兔多抗，也可以做羊，马，牛之类的。
单抗也分为小鼠，大鼠和兔子。
如果谷歌一下“Custom Antibody”， 广告铺天盖地，Organic结果更是浩如烟海。选
哪家确实让人头痛。我以前做为客户从其他公司定制过抗体(Genscript, Sigma等)，给
公司打工时也给客户做过不少抗体，现在我所在的公司也在做定制抗体，所以我对现状
还是了解一些的。下面给大家一些我的个人观点。
像马牛羊驴甚至骆驼这类大动物的多抗多用于二抗或给病人紧急用（蛇素狂犬之类的）
，这东西贵得去了，大家用不着。最常用的还是四类：兔多抗，小鼠单抗，大鼠单抗和
兔单抗。兔杂交瘤的专利好象还没过期，所以只能由Epitomics或与之相关的公司做，
其他大家都可以做。技术上，无论单抗还是多抗，实在是没有什么难度，任何一个生物
WSN租间房子养几只动物（不需要无菌，敞开养就行）就可以搞起来。成功的关键主要
有两点：1. 抗原； 2. 多做几只。
抗原好，做抗体很容易，抗原不好，神仙也没用。做免疫的可能都用过Ova，就是鸡蛋
里的白蛋白。这玩意儿往无论是老鼠还是兔子体内一... 阅读全帖 |
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p********e
发帖数: 61 | 6 兄弟是想做什么样的抗体? 多抗？单抗? 多抗多为兔多抗，也可以做羊，马，牛之类的。
单抗也分为小鼠，大鼠和兔子。
如果谷歌一下“Custom Antibody”， 广告铺天盖地，Organic结果更是浩如烟海。选
哪家确实让人头痛。我以前做为客户从其他公司定制过抗体(Genscript, Sigma等)，给
公司打工时也给客户做过不少抗体，现在我所在的公司也在做定制抗体，所以我对现状
还是了解一些的。下面给大家一些我的个人观点。
像马牛羊驴甚至骆驼这类大动物的多抗多用于二抗或给病人紧急用（蛇素狂犬之类的）
，这东西贵得去了，大家用不着。最常用的还是四类：兔多抗，小鼠单抗，大鼠单抗和
兔单抗。兔杂交瘤的专利好象还没过期，所以只能由Epitomics或与之相关的公司做，
其他大家都可以做。技术上，无论单抗还是多抗，实在是没有什么难度，任何一个生物
WSN租间房子养几只动物（不需要无菌，敞开养就行）就可以搞起来。成功的关键主要
有两点：1. 抗原； 2. 多做几只。
抗原好，做抗体很容易，抗原不好，神仙也没用。做免疫的可能都用过Ova，就是鸡蛋
里的白蛋白。这玩意儿往无论是老鼠还是兔子体内一... 阅读全帖 |
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y*****w
发帖数: 146 | 10 you just need to sort 5x10^8-10^9 cells to get your positive clone. |
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s******a
发帖数: 472 | 11 相当于500到1000个阳性细胞
我想知道我能分出来多少呢？ |
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y*****w
发帖数: 146 | 12 sorry, I miscalculated, actually, you should be able to get your
positive
clones if you have around 1-5 in the total cells (means you just need to
sort 5x10^6 cells).
The only potential problem is how you differentiate the positive clones
from
the negative ones. If the sensitivity is good enough, you theoretically
just need one clone. Normally, 5-fold should be safe enough for you to
get
one unless your have a very crappy assay.
It all depends on your assay. I would say 10-fold less of the total... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 4361 | 13 得看抗体好不好，细胞总数如果有几十亿，那还是还机会的。 |
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y***j
发帖数: 11235 | 14 十几个每M我做过，是可以的，然后PCR检测，基本上能和流失结果对得上。
但是效率很低，保守估计只能得到1/5的细胞，当然也可能是我们的core太烂，很多人
骂。 |
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c********r
发帖数: 1125 | 15
原
请原谅我外行乱说，但是免疫学发好文章并没有那么难吧。。。热门坑在免疫学里面也
不要太多。。而且很多免疫学的实验真的因素很复杂，通路信号交叉繁复，可研究的还
是满多的。。。
而且相比神经来说免疫的资源要求很低，生化，细胞，流式，加上买来的老鼠几乎就是
一切了。。。神经？发育／行为／电生理都相当的慢。
不过找位置可能你说的是对的，神经比免疫容易一些（国外），国内的话我不觉得免疫
很难找位置。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 免疫荧光半定量还是可以的吧，只要严格处理样品也是不可以的，很多这类的数据都发
表了啊。比如你sample处理要很一致，比如所有的切片同一天染色等等等等，然后拍照
片的时候必须都用同样参数，不能饱和，等等等等。。。然后拍照片的区域要大家都差
不多，等等等等。
有的时候很难用其他办法吧？比如我A蛋白cell specific KO了是否引起B蛋白上调，但
是我的组织里面有n种细胞，很可能有相邻细胞影响，我用WB或者mRNA分不出来到底是
谁啊，用流式分细胞是不是处理过程中会改变啊，。。。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 17 以前实验室有人做过， 把细菌培养物扔给培养的巨噬细胞然后收集划板数克隆。 还可
以用beads模拟， 用流式测吞噬的beads。 |
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b***q
发帖数: 18 | 18 职位职责：
1. 负责公司分子细胞生物学方面的产品及服务项目的运作及管理；
2. 熟知公司产品应用，为客户提供产品信息及应用咨询；
3. 落实项目的进度目标，保证项目的正常实施，优质高效地完成项目任务；
4. 做好项目的基础管理工作，保存各种文件、记录、数据等资料；
5. 及时准确与负责人沟通项目进展，提供技术支持；
6. 建立客户档案，进行重点客户的回访。
应聘要求： 1. 分子生物学、细胞生物学、生物化学等相关专业硕士及以上学位；
2. 具备良好的分子细胞生物学实验技能，熟练掌握分子克隆、载体构建、细胞培养、
RNAi等实验技术；
3. 有学习新的知识及技术的自觉性和主动性；
4. 优秀的沟通能力和团队合作精神；
5. 良好的英语口语和书面交流能力；
6. 具备事业心及责任心，独立思考，自主发现及解决问题；
7. 能够在快节奏的环境中工作，吃苦耐劳，有较强的承担压力能力。愿付出额外的努
力积极主动地克服工作中遇到的一切问题；
8. 有哺乳动物细胞培养、RNAi、病毒包装、稳定细胞系构建、流式等经验者，优先考虑
北京安必奇生物科技有限公司是由一批资深留学归国人员创办的生物制药服务... 阅读全帖 |
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s***c
发帖数: 1664 | 19 谢谢~~
原来学环境微生物，毕业博后一年多点，随家庭ｒｅｌｏｃａｔｅ到弯曲，先后在两家
公司做流式和ｑPCR，一家不能办h1，一家被收购，我最后失业，又找了一年工作没有结
果。
我虽然phd但比较弱，只有一篇文章（一作），所以tech的工作我也可以接受。但是我离
开学校有一阵了还有gap，担心很难再回学校。
我会flow cytometry, multi-color immunoassays, qPCR, microRNA methods, ELISA
, gas chromatography, HPLC，其他我也很愿意学，也愿意从头开始。
实在不行我只能为了工作回国，又要和家庭分离，所以厚着脸皮上来发贴，如果担心我
的能力，我也可以从volunteer做起。。。 |
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f****6
发帖数: 365 | 20 目前的课题，我们用一个表面分子标记了一群特征性的T细胞亚群，这是一个新发现，
以前从没有人报
道过，而且我有microarray的结果，上面罗列了几乎2000基因在这群细胞上的高表达或
者低表达，这
几乎是个寻宝图。我认为这是个新领域，在这群细胞上有很多可做的。
假如我离开目前的组，我能在其他组或者回国继续做这个吗？虽然用老板发现的分子标
记可以界定这群
细胞，但我在实验的过程中又陆续发现了其他两个标记，假如老板不让我用他发现的标
记，我是否可以
用我发现的那两个标记去研究他们？
实在是对老板失望了。组里一个4个人：老板（黑人），一个白女孩（ 博后),另一个白
女孩 （技术
员），加上我（博后）。上周老板对我说技术员只想管少量老鼠，所以老板要我分管60
多笼老鼠。我问
为什么我要管那没多老鼠，那个博后也应该管一些老鼠？老板立即脱口而出：No, she
is postdoctor.
我说：难道我不是博后？他一下楞了，然后说：那些老鼠都是你的。 然后我去查了那
些老鼠，发现大
多数都不是我的用的，有些品系是储备品种，有些是共用的。
其他事情我都不想说了，总之，老板对那两白女特别偏袒，她们的... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 1125 | 21 说个可能得罪很多人的话。
纵观生物著名期刊造假的例子，你可以发现90％是两大类
（1）western造假，常见于研究信号转导，磷酸化，凋亡。
（2）细胞流式造假，常见于免疫领域
其中（1）占到一大半，再分其中蛋白磷酸化／去磷酸化 又占到一堆。
我不好说生化的所有东西都是artifact，但是相比遗传和发育等大家人人可以重复的东
西，生化造假太容易了。
你看看fu xiangdong 3P, Karin, 无数著名造假哥都是在磷酸化上造假。
3P 的很多造假没有人能重复，他照样能发cns。
我对lu zhiming没有意见，但是我觉得他做得东西需要时间检验。 |
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h***a
发帖数: 145 | 22 最近设计实验，但不知道这个实验是不是doable.请大家帮帮眼
我想做single cell的 transcriptome（可能只会取一部分感兴趣的gene做）.
具体就是取细胞，染抗体，上流式分离细胞。然后分出来的细胞提rna,转录cDNA, 在做
microarray /next generation sequencing?(这个我只听过名字）/real time PCR?。
。考虑是rna 和cDNA 的效率和量不知道能不能往下做。
做过的同志指导一下吧。 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 23 请教版上有没有朋友做过细胞直径分布测量实验的，cell size distribution.
研究TSC-mTOR signaling 的经常要测量细胞直径，有人用流式细胞仪，也有不少用
cell counter的。
我最近做了几次，用的是cell counter，得到的细胞直径分布图一般都是不规则的曲线
，而文章里面的一般是类似正态分布曲线图
请问有这方面经验的版友，这个实验有什么关键的注意事项?
附图1是截取一篇cell文章里的结果
附图2是我自己的一个结果
多谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 24 马上用肯定会有影响，这玩意儿还是比较伤细胞的。
你如果要测活细胞的性质，最后恢复一两天至少，如果
测酶估计没事。我就理论分析，自己没做过 |
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h********0
发帖数: 944 | 27 我感觉同种抗体识别膜蛋白和细胞内蛋白在信号强度上可能会有差别，不知道流式仪能
不能足够敏感去检测得到 |
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h******y
发帖数: 351 | 29 Guava is a flow cytometer, not a sorter. |
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e***o
发帖数: 344 | 30 谢谢各位的回复。不知道这款机子能不能加sorting的模块。 |
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s**********a
发帖数: 92 | 31 如果一个蛋白核表达，而不是膜表达，有什么办法把高表达的分离出来么？
像用流式分离膜表达蛋白细胞那样。
谢谢！ |
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s**********a
发帖数: 92 | 32 谢谢上面两位的回答。
我的目的比较简单，就是我现在手头有一个基因，在某种特定肿瘤中高表达。我现在已
有构建好的稳定表达的细胞系。想看看能不能在肿瘤组织中分离出来高表达的细胞 （
要活的），拿出来做进一步的实验。
而这个蛋白是核表达。
要是膜表达，可以用流式分离。
所以想问问大家针对核表达的情况，有没有好的方法。 |
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g*******r
发帖数: 129 | 33 看看能不能做成GFP fusion protein, 然后用流式分离。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 34 我们目前用的是ARIA， 挺好的，优点是体积小，操作方便，缺点是aborting
rate高（挺资深技术员说的）。 Moflo 我只用过一次，感觉太大了，操作不便。
我看过不少实验室，大部分bd的 |
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q******g
发帖数: 3858 | 36 我们也用BD的。Beckman的离心机不错，没用过他们的的flow. |
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n*******l
发帖数: 190 | 37 我们现在也用BD的AriaIII.我觉得操作起来很简单.至于Aborting rate,至少我们的机
器没有这个问题.我觉得这个和操作员以及所有使用机器的人,还有不同机器的状态有关
. 有的人不太会用就成天抱怨机器不好.从AriaI出来的时候就一直用这个系列.没有遇
到什么大问题.BD的后勤还好吧.只要你交了contract的钱,出了问题他们全都解决.我们
分选神经细胞和干细胞,应该是最脆弱的细胞之类了. |
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s****9
发帖数: 932 | 38 如果有钱雇一个专门的techician操作machine，选Moflo。
如果postdoc和学生操作，果断选Arial III。
Moflo性能更好，但操作复杂，换个nozzle，挑个laser setup折腾时间太久，maintain
更麻烦。Airal III更容易setup，更容易操作。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 赞第一手经验！
搭车问一下，那种特别小型的sorter, 比方说 BD FACSJazz cell sorter， Bio-Rad
S3 Sorter, 大概得多少钱啊？
我们有可能需要sort 活的酵母，但是没有人愿意给我们做这个，所以有可能会铤而走
险自己买一台。但是太贵的话又买不起。
maintain |
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e***i
发帖数: 188 | 40 FACSHazz about $220k, S3 around $140k |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 太贵了。哎，没有办法了。要是有个５万块以下的还勉强可以考虑一下。
谢谢你提供的信息啊！ |
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s****9
发帖数: 932 | 42 除非你天天用，不然不值得，你还要需要买BD的contract，不然坏了你就头大了，BD修
东西宰人很厉害。
我们几乎天天都用，买仪器可以走HHMI，都觉得不划算。最后和另外两个lab合买合用
，合share maintain的钱。
你可以用别人的BD AriaIII sort你的yeast，最多你自己买个大size nuzzle。Aria是
一个闭合系统，用完了run半个小时bleach好了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 谢谢！你的建议非常有道理。
不过我们学校的两个中心都一口回绝不肯给我做。主要是酵母这个东西一旦污染上了就
很难除掉。我们学校的另外几个酵母实验室都是穷鬼，要忽悠他们来合买这个仪器很难
。我本来以为分流仪和分析仪的价格会差不多（最便宜的那种FACS好像５万能拿下），
但是现在看来要贵得太多了。
我现在就想看看是不是有其他学校的实验室也sort 酵母，大不了就飞过去做吧。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 if can share instrument to do high throughput sorintg
pls try
BD Fortessa Flow Cytometer
//www.fluofarma.com/pageseditos,89,left_2354BC5D,high,throughput,flow,
cytometry,automated,confocal,imaging,laser,scanning,cytometry,high,
throughput,fluorometric,imaging.html
>Spec:
► Functional measures using an automated 384-well plate flow
cytometer
► Multiplexing analysis: measures up to 18 parameters simultaneously
in single cells
► Large Capacity: acquisition of 40 000 events per s... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 242 | 45 这个简单。买个二手的就行了呗。五万肯定有，还是不错的。关键是service contract
。买旧的一定要有full service，全包的那种。买来了就往死里用。还有一点，不要买
新牌子，考虑一二代前的。good luck！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 Bingo
http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistaSearchDetails.cfm?LVi
or Sale: Beckman Coulter Epics ALTRA Cell Sor Beckman Coulter Epics ALTRA
Cell Sorter with HyPerSort Cell Sorting. The Epics ALTRA
Originally Found: Thursday, April 18, 2013 Location: Holly, Michigan, USA
or
Item ID:6000588
Manufacturer:Beckman Coulter
Model:Z2
Category:Cell Counting / Sorting
Subcategory:Cell Counter
Warranty:30-Day Money-Back Guarantee
Condition:Used
Location:Boston
Price $6,995.00 usd
http://www.biosurp... 阅读全帖 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 48 ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.dyndns.info)◇◇
掀起你的盖头来，走近“世界五大免疫学家之一”臧敬五
作者：江湖小傻
一些新闻：
劳玉仪引入3位新董事，形成为董事会班底的“三驾马车”：免疫学教授藏
敬五博士、在台湾和美国科技界拥有20多年从业资历的贝斯科技主席刘助、来自
投资银行界的尹铨兴。同时，太阳神主要产品虽仍为甘菊口服液、猴头菇口服液、
风暴减肥胶囊、多补钙、鸡精、乳酸奶、矿泉水及蒸馏水等保健消费品，但多年
来已投资了广东太阳神（集团）有限公司（占95%股份）、广东太阳神集团荔城
制药厂（占100%股份）；上海太阳神复旦高科技产业有限公司（占50%股权）、
北京美联胚胎生物工程有限公司（占40%股份）、Data Logistics（占45%股份）
及建北集团有限公司（占0.7%股份）等多个医药科技公司，且公司在京、沪、穗
等地都有分布，符合劳玉仪“在内地多个中心城市设立研发中心，和京沪穗当地
大学、医学机构开展合作”的计划。“三驾马车”的组合令新太阳神凸现科技与
投资联合的国际水准。45岁的藏敬... 阅读全帖 |
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b**********a
发帖数: 25 | 49 我既无身份，又只是一个博士后，你以为我不想和他开诚布公谈一谈？他要能谈我也用
不着公开和他们叫板。我来了一年，我的文章准备投顶级杂志，从这你也能知道我做的
不错，可是无能我做得多好，永远取悦不了他。
老板和她当着我的面调情。当着实验室人的面调情，肆无忌惮地造假。这些我本来无所
谓。但是肆无忌惮地欺负我，我早已忍了好久了，他们根本不觉得我忍让就对我网开一
面。如果我不反击，他们根本不会收敛。我说了她的data是假的之后，她在另外一个流
式细胞仪上做了一遍（那个机器要收费，任何人都只有自己的密码，所以不能copy到她
的原始数据，肯定也是老板搜意她在另外的流式细胞仪上做的，我也怀疑他们请了人
run 了她的样本，因为她如果自己RUN样本，图形实在是惨不忍睹），他们以为这下结
果对了。那天她示威似地在lab meeting上正式地用powerpoint show data，结果我问
了个问题： 你的naive的Balb/c 老鼠的外周
淋巴结细胞中15%的CD4+ T细胞能马上分泌IL-10？我很好奇这都是些什么细胞？ 老板马
上阻拦我说：她的老鼠和你的老鼠不一样，不同的老鼠strain情况... 阅读全帖 |
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l******3
发帖数: 25 | 50 是目的基因就有6k多，克隆到lentivirus载体里，在做流式sorting，可行吗？ |
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