C****n
发帖数: 79 | 1 我随机挑取了5个单clone， 提gDNA， PCR然后测序，这五个mutants之间的序列是不同
，但是对于每一个clone，只有一个测序结果，也就是说两个allel都突变成一样的序列
，这就很奇怪。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 2 和你描述的有啥区别？只是一个convert to wildtype 你的是convert成另一个allele
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2 |
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b******s
发帖数: 1089 | 3 我们以植物为模式，动物里似乎有人做过诱导型cripr，我想做组织特异性或者诱导型
的，但是cripsr不是只能在一个拷贝上产生突变，请问怎么解决突变allele的问题？能
不能推荐些文献？谢谢。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 4 你觉得工业界的R&D效率就一定更高，对于有些方向也许是，肯定有我不了解的东西。
不过打比方对于罕见遗传病基因的寻找，工业界几乎没有贡献，基本都是学术界的功劳
。但是每个基因的发现，直接使所有该遗传病患者和其家庭获益。这是一个小例子。前
面我举的几个个体化医疗的target mutation，也不是什么工业界做出来的。
关于你说的第二点，你可以去看看现在的nature genetics， A J Human Genetics，每
一期都还有n个新的单基因疾病基因被克隆，这个能叫做already defined？而且现在主
要还只能做这些high penetrance的单基因，low penetrance的难度更大，还有很多空
白点，这个工作还根本没有做完。人20000多基因，不说所有基因都和单基因有关，就
算1/3和单基因有关（这也是学界公认的比例），7000左右，现在还只有4000多被“
define”了，留给遗传学家的东西还不少。
而如果是bi allelic 致病，理论上你需要的sample size是做单基因疾病的平方。你想
想现在还差多远吧。 我们现在看到貌似常见的肿瘤（前面... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 5 你觉得工业界的R&D效率就一定更高，对于有些方向也许是，肯定有我不了解的东西。
不过打比方对于罕见遗传病基因的寻找，工业界几乎没有贡献，基本都是学术界的功劳
。但是每个基因的发现，直接使所有该遗传病患者和其家庭获益。这是一个小例子。前
面我举的几个个体化医疗的target mutation，也不是什么工业界做出来的。
关于你说的第二点，你可以去看看现在的nature genetics， A J Human Genetics，每
一期都还有n个新的单基因疾病基因被克隆，这个能叫做already defined？而且现在主
要还只能做这些high penetrance的单基因，low penetrance的难度更大，还有很多空
白点，这个工作还根本没有做完。人20000多基因，不说所有基因都和单基因有关，就
算1/3和单基因有关（这也是学界公认的比例），7000左右，现在还只有4000多被“
define”了，留给遗传学家的东西还不少。
而如果是bi allelic 致病，理论上你需要的sample size是做单基因疾病的平方。你想
想现在还差多远吧。 我们现在看到貌似常见的肿瘤（前面... 阅读全帖 |
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f********e
发帖数: 15 | 6 最近在做CRISPR突变，得到一些indel mutation。因为是hetrozygous， 所以不做TOPO
cloning就看不出每一个allele的序列是什么。
记得以前有人曾经提到过用一个软件可以直接分析heterozygous的indel mutation序列
，只是现在记不得了，不知有人知道有什么样的免费软件可以进行这方面的分析？另外
，这样的准确度有多高？是不是就不用TOPO cloning了？ 多谢指教！ |
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l********e
发帖数: 415 | 7 三个的话只有subclone,
因为从理论上,你无法把一个位置上的三个峰正确分配到三个未知的allele上 |
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C****n
发帖数: 79 | 8 你筛了多少个突变子？遇到过三个allele 同样的突变吗？也就是Homozygous的情况。 |
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N******n
发帖数: 3003 | 9 主要看看那个基因和疾病有关，上千的copy number and mutation data, expression,
从中选出相关的基因。但是在copy number上有下面的问题：
CNAs是2， LOH： L
如果单独看CNAs是正常值2， 但是这个LOH说明丢失了一个allele，
这样的信息怎么和CNAs,2, LOH,H 做对比？
我的初步打算是把他们当正常看待。 |
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f****y
发帖数: 13 | 10 理论上是的，但实际很困难。因为当你比较诱导突变型和野生型，你肯定可以发现上千
的SNPs,所以需要传统的遗传基因定位法。当然虫子容易拿到突变体，如果你能同时拿
到5，6个同基因不同的alleles,还是可能不需要定位了。
step |
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s********9
发帖数: 132 | 11 Thanks for the reply.
But in pratice, if one has to do this. What I can think of are:
1) as you said, hoping the homologous recombination during meiosis.
2) get a B+/- allele in A+/- background? 50% chance it would be on the same
chromosome.
Just don't know what people actually do in reality.
BTW, one pertinent questtion, when one makes transgenic mouse, is it routine
to pinpoint the integration site? (People often cross a transgenic mouse
with a KO mouse or transgenic mouse)
Especially for Cre-... 阅读全帖 |
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s********9
发帖数: 132 | 12 I simply brought this up out of curiosity for discussion. I have NO hands-on
experience with mouse genetics whatsoever.
For double KO. the chance gene A and B on the same chromosome would be 1/20.
People have done so many double KO. I figure this could be a practical issue.
For crossing CRE-transgenic mouse with LoxP mouse to produce tissue-specific
KO.
The chance are also 1/20 the CRE-transgene and your LoxP-cassette being on
the same chromosome.
I don't think it's necessary impossible to achie... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 13 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。 |
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j******i
发帖数: 939 | 14 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧 |
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发帖数: 1 | 15 It's an interesting question. To the best of my knowledge, no RNA-seq
alignment tool was designed to tolerate CRISPR-mediated indels to date. I'm
not an RNA-seq expert, so it's possible that there are some on the way. You
can also email Luca Pinello, the author of CRISPResso. He might know more,
and he's a really nice guy.
Here I'm trying to think about a solution. There are two situations - I don'
t know which one is your case.
a) The sample for RNA-seq was derived from a single mutant clone. I... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 16 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
项目 结题
date： 2017年8月2日
updated: 2017年8月4日
Note2017080401: added a few notable reviews/summaries
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- NBT retraction note：
http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#correction2
原文引用
“Retracted online 02 August 2017
We are retracting our study because of the continued inability of the
research community to replicate the key results in Figure 4, using the
protocols provided in our paper. In this figure we report that the
Natro... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 415 | 17 Wild type allele conserved between mouse and human? |
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g***o
发帖数: 92 | 21 Digital PCR is the way to go. Let me know if you need help. |
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s*********y
发帖数: 292 | 22 你如果样品少，可以把PCR产物克隆到T载体（或者任何载体）上，然后挑几十个克隆去
测序。这是可以接受的笨方法，至少，bisulfate sequencing之类的东西一直都是这么
做的
当然，只适合少量样品 |
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r**********e
发帖数: 587 | 23 很感谢。虽然笨但很好
我就是想问下，如果从最简单最快的pcr sanger sequencing看到差别，那么有多少把
握／信心接下来的精确定量会有显著差别呢？ |
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l*****7
发帖数: 8463 | 24 你的DNA原始样品来源是什么？
1 纯的， 单一细胞？ （比如：克隆的纯细胞）
2 多样细胞的混合DNA （比如：血液细胞）
区别 |
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r**********e
发帖数: 587 | 25 单一细胞
genomic DNA from cell lines |
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l*****7
发帖数: 8463 | 26 1 有不少的细胞线是多克隆的。
2 先做digitalPCR比较省工呀。 |
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l***y
发帖数: 638 | 28 样品少就克隆测序
样品多或者经常要做的找个有miseq的地方跑一下，便宜的很 |
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l********e
发帖数: 415 | 29 Reference genome带minor allele很常见 |
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h*****x
发帖数: 147 | 30 张口就来
清华最近几年平均每年2-3篇非结构生物学CNS文章, 5-8篇结构生物学CNS文章
施一公回国前, 清华生物系历史上只发表过 1 Science(非结构), 1 Cell(结构), 物理
和化学系两三年有 1 Nature or Science
以下是今年清北在nature发表非结构生物学文章, 其他机构和Sceince, Cell文章我懒
得查了
Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian
development
By: Zhang, Bingjie; Zheng, Hui; Huang, Bo; et al.
NATURE
The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos
By: Wu, Jingyi; Huang, Bo; Chen, He; et al.
NATURE
Tracing haematopoietic stem cell formation ... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 对BP系统不熟悉。你上次说可以不留下任何痕迹，那肯定比Cre/LoxP好。LoxP我记得蛮
长的，就是在initron里，也担心影响splicing。
个人觉得没必要两个颜色的selection maker。这样导致在两个homologous arms之间的
insertion太大。看了他用PCR来确认正确克隆，实际上是两个HDR arm上一边一个PCR来
确认的。不知道是不是担心PCR有不确定性，还用了southern来证明integration site
。这个太麻烦。从他用一个颜色的selection marker（Fig2)来看，拿到double-
replacement的效率不错，40%。说明一个颜色就可以了。或者，我就干脆用一个G418。
我记得一个G418的表达cassette只有1。2Kb,在这个cassette两边加PB,PB外面是HDR的
arms,一边1kb。这样，要确认正确克隆的时候，用一对在HDR template外面的PCR
primers,就可以解决了。这个PCR产物是1+1。2+1=3。2kb，NEB的Q5 polymerase应该可
以了。 |
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发帖数: 1 | 35 他这篇文章出来了，如果只是再在homologous arm的外面，
再加了一个第三种荧光来作为random integration的negative selection，能够被
Nature系统的杂志接
收吗？
site |
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发帖数: 1 | 37 他都只能发Sci Rep，你再加点东西为啥就能上NBT？
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:他这篇文章出来了，如果我跟他的思路一模一样，我只是再在homologous arm的外面
，再加了一个蓝色荧光来作为random integration的negative selection，能够被NBT
接收吗？
:site |
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发帖数: 1 | 39 以前的方法都是很繁琐的，需要大量的花费时间和经历去筛选那种没有random
integration并且两个拷贝同时被准确突变的细胞。该篇文章首次使用两个donor带有不
同的荧光，来鉴定双拷贝同时被突变的细胞。
Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
http://www.nature.com/articles/srep38198 |
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发帖数: 1 | 40 你被scoop了…
还是这就是你的文章？
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:以前的方法都是很繁琐的，需要大量的花费时间和经历
:Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
:Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
:patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
:http://www.nature.com/articles/srep38198 |
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j****n
发帖数: 3370 | 41 其实还是有意义的吧？
已有研究表明 两个allele表达调控什么的会有区别的 |
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S*****h
发帖数: 21 | 42 我都没考虑也可以认为是a 抑制b. 做些在突变体背景中过表达的实验。epistatic
analysis 很多时候很难明确给出上下游关系。 也可以尝试用表型不明显的weak
allele，但你double 不一定会看到抑制。 还有就是辅助看蛋白的定位，表达之类。
: 我也觉得因为表型居中所以难以判断哪个suppress哪个。请问有没有什么
实验可
以进一
: 步验证？
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j****n
发帖数: 3370 | 43 没试过
有两个小疑问
ko除非用hr把整个cds干掉 不然即使ko了 transcriotion不受影响吧 nhej一般也就几
个bp的变化
如果只ko掉一个allele 会显著影响基因的表达吗？印象中 一些highly regulate gene
一个copy或者两个copy 转录水平没啥区别 |
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a*********n
发帖数: 390 | 44 1. 会造成frame shift或者stop codon
2. 是的，杂合子不能算ko，要经过一次减数分裂才行，或者直接ko两个allele
gene |
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发帖数: 1 | 45 我倒不那么认为，我不觉得作者会那么low。问题是人家就那么随随便便一测就能发现
如此多的随机突变，这个从概率上来说，已经可以说明问题了。不要因为不喜欢别人的
结果而坚持要推翻别人的结论。
在supplementary的数据中写道：FVB/NJ mice, which are inbred and homozygous
for the retinal degeneration 1 (rd1) allele of Pde6b, were purchased from
The Jackson Laboratory, (Bar Harbor, ME). Co-housed FVB/NJ mice without
CRISPR-mediated correction were used as the functional-deficient control.
Briefly, an sgRNA- expressing plasmid had been coinjected, into FVB/NJ
zygotes, with the single-stranded oligodeoxynucle... 阅读全帖 |
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c***y
发帖数: 615 | 46 allele frequency 大于1，怎么解释啊 |
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T****i
发帖数: 15191 | 47 计算机属于上游产业，无论什么行业都需要。即使IT业发展这么多年，仍然有很多角落
没有被IT的光芒照耀到。各行各业都有海量数据，维护和分析都是很大挑战，老数据库
老软件的升级换代，都等着人来解决。更别提自动化和人工智能方面的需求，只会越来
越多。比如我工作涉及到的一些数据库管理和数据分析，公司里一直靠半手工，效率低
，效果差，麻烦。我入职后，折腾了一段时间，终于想了个办法，找了几个人准备搞软
件包来自动分析，搞完了，就可以让大家把精力放在其他暂时还不适合自动化但非常重
要的工作上，比如跟客户沟通，产品设计。
生物有一天也会自动化，比如HHMI就有四台机器，自动給果蝇换培养瓶。公司里面，就
是做genotyping, 一般也都想法high throughput了，要么直接sequencing，要么
allele-specific QPCR，Taqman，96孔板或者384孔板，没人跑胶。连western一样半自
动化，原先得雇几个千老跑胶转膜加抗体，现在只需要一个技术员加样就行了。实验记
录也完全电子化，到处barcode。而这些只会降低对只懂生物的千老和学生的需求，增
加对计算机专业的需... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 48 *Penetrance in genetics is the proportion of individuals carrying a
particular variant (or allele) of a gene (the genotype) that also express an
associated trait (the phenotype).
**Which country has the highest rate of schizophrenia?
6 to 12 million people in China (a rough estimate based on the
population)
4.3 to 8.7 million people in India (a rough estimate based on the
population)
2.2 million people in USA.
285,000 people in Australia.
Over 280,000 people in Canada.
Ov... 阅读全帖 |
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M*****e
发帖数: 501 | 49 就算这个基因决定智力,
他也没有说欧洲人多的那个allele就让人更聪明啊,
也就是进化上比较有优势而已.
当然,潜在的可以被人解释成种族主义,
但是在science上,是没有solid的证据的,
作者也没有这么说.
量 |
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e*******n
发帖数: 2178 | 50 只有“大”突变才能产生新物种，是不对的。这里物种的定义是产生的生殖隔离。
举个例子，Drosophila simulans 和D. melanogaster他们的染色体数目都是一样多的
，而且除了及其个别的基因，都是共线性的。但是他们之间的后代要么不育，要么就干
脆死翘翘。
原因在于什么地方呢，在于他们的基因的功能不能incompatible了。
让我们假设一下他们共同的祖先的genotype是aabb，在某一个时候，这个祖先的
population被分割成两个population了，这两个population因为物理阻隔之间没有基因
交流了。在一个population里面，genotype变成了AAbb。在另外一个population里面，
genotype变成了aaBB。 假设这个时候物理隔离没有了，这两个物种又可以自由交配了
，那么后代的genotype是AaBb。这个时候大家要注意到在进化的历史上A，B这两个
allele并没有互相见到过，那么就没有理由保证他们一定能够在一起稳定工作，如果他
们不能一起稳定工作，从而造成hybrid死亡或者是不育。那么这两个原来被物理隔离的
p |
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