T**********t
发帖数: 1604 | 1 Pierce专门有测biotin labeling efficiency的kit，不过我嫌麻烦没买。
我做fluorophore labeling也是用它家的kit，反应的chemistry都差不多，那个的
efficiency不错，我就将就认为biotin label的也不错了。
biotin-streptavidin的binding很好的，我用biotin label的peptide和streptavidin
beads incubate，前后能相差80%。
还有一个可能，就是你的protein太多，beads太少，beads饱和了。 |
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V**D
发帖数: 2869 | 2 冬天由于天冷干燥，打网球手指(主要是右手）很容易脱皮，严重时会开裂，如果每次
打前涂点凡士林，情况会好一些。最近服用了biotin (5000 mcg, 每天一颗） ,发现
biotin对防止手指脱皮的效果比凡士林还要好，现在都不用涂凡士林了。
如果各位有手指开裂的困扰，不妨试一下biotin. |
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a*****n
发帖数: 2835 | 3 呵呵
我也想知道答案。曾经做过biotin－strepavidin pull down，查到的资料说结合很强
，需要6M 盐酸胍才能break
我用的是cleavable 的biotin试剂，不需要破坏biotin－strepavidin的结合 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 Avidin和Streptavidin都是Tetrameric，可以bind多至4个biotin分子。没听说过一个
biotin分子会bind多个Avidin的。
不过我不太明白你的描述，可能是我没理解透你的实验设计。你的Ab是Anti-target的
还是Anti probe的啊？还有就是你的target是Avidin containing，probe是
biotinylated，那你怎么知道Target-probe的binding是发生在Avidin-biotin之间还是
target-probe之间啊？ |
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y*********1
发帖数: 46 | 5 Thermo Scientific has a Biotin 3´ End DNA Labeling Kit (Product # 89818
) that uses TdT to incorporate biotin-CTP into DNA. |
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c***y
发帖数: 615 | 6 This is what I have been thinking.
Is biotin at the end affecting the PCR efficiency and the purification
procedure afterward? Are PCR and PCR purification affecting the biotin's
existence at the DNA end? |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 very good point! I used zeba column to get rid of free biotin, but
never really tested the efficiency (in fact now I think of it,
it'll be hard to measure how much free biotin is left... do you
just do multiple column purification to make sure of that?)
2. sorry can you elaborate on the elution part? I don't quite
understand the purpose for eluting after binding w/ beads. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 嗯，就是incubation前后各取样测浓度。我是用Pierce的BCA assay kit做的，因为我
的peptide没有280吸收峰不能直接nanodrop测浓度。但是因为我样品少，用的是
microscale做的，所以incubation之后的浓度实际上已经很接近noise水平了,真正的
binding efficiency我感觉应该会超过80%的。
Streptavidin beads的instruction上应该有说它的binding capacity，一般用的标准
是mg biotin单抗/mg beads，你得用你的蛋白的size和单抗的size大概齐毛估估一下，
估计一个适当的蛋白浓度来做incubation，beads多一点没关系，蛋白用多了就可惜了。
嗯，不过beads也不便宜就是了。:)
测biotin labeling efficiency的kit是这个：
http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=A26353CB-5056-8A76-4E52-41073BE96118
不过我从来没用过啊，不知道好不 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 9 只要ratio对了，蛋白总是能bind完全的。我不觉得你会有90%的蛋白都label不上
biotin。这个biotin label是通过和蛋白的Lysine或者Arginine反应结合上去的，反应
效率很高。除非你的蛋白里根本没有或者很少K和R残基，否则应该考虑的是over-
labeling的问题而不是label不上的问题。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 10 被拆穿了-_-我其实是偷懒，assume biotin只能跟一个avidin bind，所以assume
有signal的话应该是probe跟target bind，biotin跟avidin-ab bind。但是
结果发现negative control（有avidin没target）也有很强的signal。。。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 要求本身MW小，能与某protein有很强affinity（类似biotin-avidin），
最好很常用，可以买到各种conjugate form。除了biotin还有什么
好的候选？多谢！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 多谢！我想要的是biotin-avidin之外的interaction，因为我要做sandwich
assay，capturing agent用了biotin了，detection agent要换个别的 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 13 就像3楼所说，biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
，也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR，和普通PCR的条件是一样
的。跑完PCR之后，用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
段分开。 |
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f*****Y
发帖数: 20 | 14 请问biotin conjugated ATP是否cell membrane permeable? 我想直接label细胞里的
nascent RNA。biotin-ATP是从哪一家公司买的？ |
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f*c
发帖数: 2726 | 15 荧光标记DNA，用的digoxigenin-dUTP and biotin-dUTP, 背景好强阿，不知道怎样可
以减弱背景，我用的自己的blocking buffer,不知道用roche nucleic acid blocking
reagent会不会好一点？
我看别人 dig or biotin detection 是在37度，可是我平时做细胞IF都在室温，温度
高一点是不是背景反而会更强？
谢谢 |
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f*c
发帖数: 2726 | 16 我不是做southern,我做immunofluorescence, 放到显微镜下看的，DNA 上有标记（
biotin)，再用streptavidin-FITC去识别biotin, 相当于western |
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D******n
发帖数: 2836 | 17 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: DaShagen (Unbearable lightness), 信区: Biology
标 题: how to add a biotin to a residue in silico?
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 26 18:45:49 2010, 美东)
my friend wants to attach a biotin molecule to a lysine of protein and then
do some energy minimization.
I managed to add the molecule in pymol, but probably it is not in its favora
ble conformation. Anyone can suggest a software to do it?
thanks |
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p****u
发帖数: 239 | 18 用DCC?反应完DCU很难除掉吧，Biotin溶解度也不好。
EDC或HATU吧，要不先搞成Biotin-NHS。 |
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f***e
发帖数: 169 | 19 儿子皮肤干燥，面部湿疹严重，大夫说有可能是生物素缺乏，让吃Biotin,我们现在在
国内，只能找朋友帮忙代买，版上的姐妹们知道哪个牌子，或者哪家店的生物素好吗？ |
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D******n
发帖数: 2836 | 20 my friend wants to attach a biotin molecule to a lysine of protein and then
do some energy minimization.
I managed to add the molecule in pymol, but probably it is not in its favora
ble conformation. Anyone can suggest a software to do it?
thanks |
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l*******u
发帖数: 14 | 21 The interaction between streptavidin and biotin is as strong as a covalent
bond and can not be broken by SDS boiling. |
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g******e
发帖数: 21 | 22 探索一种sensor中，以biotin为检测对象得话，多低浓度才能称得上高灵敏呢？
nM是不是很差的啊？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 23 how do you know your proteins are on the beads?
how about biotin competitive elution? |
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s****a
发帖数: 436 | 24 Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: A protocol for
quantitative elution。
For elution of biotinylated proteins, 500 mL
release solution (2% SDS, 30 mM biotin, 50 mM phosphate,
100 mM NaCl, 6 M urea, 2 M thiourea, pH ,12)
were added to the resin and incubated for 15 min at RT,
followed by incubation for 15 min at 96C. Afterwards, the
resin was pelleted by centrifugation for 5 min at 16 100g |
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c***y
发帖数: 615 | 25 想鉴定一个DNA序列是否与蛋白的DNA binding domain相互作用。初步打算用biotin对
DNA进行末端标记, 然后用streptavidin beads
请有这方面的经验的指导一下,什么方略比较好,或者推荐个kit/protocol 什么的
DNA序列目前在pGEM T -easy vector里, 200-300bp 的长度
多谢 |
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y**y
发帖数: 36 | 26 自己没做过 实验室同事做过 她是直接合成的50b左右，biotin标记， 和核裂解液incu
bate, pull down, WB, ....
2 300合成太长了吧， 你对该蛋白的结合信息应该有一点吧 包含该位置有可以了啊
good luck |
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p*****c
发帖数: 1506 | 27 在purified protein上做biotin或streptavidin标记,非anti-his抗体的
欢迎提供相关信息
多谢 |
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w******e
发帖数: 1187 | 28 就是pierce的那个。想请教一下通常的yield有多高？第一次pilot，biotinylate后
跟streptavidin beads incubate，然后测bead上protein跟original input比，
只有10％，比预想低很多。biotin-avidin interaction应该不可能差。想到的只有
biotinylation本身出了问题。
多谢！ |
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a*****n
发帖数: 2835 | 29 1, 标记完之后要使劲洗，洗掉free的biotin
2，binding完了之后怎么elute的？elute效率可能有问题 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 30 biotin-streptavidin binding很牢的，不用变性剂洗脱不下来。是不是搞混了？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 31 avidin-containing target + biotinylated probe + avidin-containing Ab,
看到了signal。可是只记得一个avidin能bind 几个biotin。莫非avidin
multimer会dissociate，and then interact w/ exogenous avidin? |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 一般就用地高辛和抗体了，要像biotin那样强的没有了。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 33 Ic. Thank you for the input. btw, I know a lot of fluorophores
(like fluorescein) have antibodies too. If I have to use Ab,
would conjugating some fluorophore work better than DIG?
I guess my question is: why is DIG so commonly used if it
doesn't offer good affinity as biotin? |
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s****l
发帖数: 395 | 34 primer合成时加biotin，一般可以到80nt，DNA大小限制应该不大，几kb应该都能
pulldown下来的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 35 这个是长的probe，普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp－500bp，
取决于反应时间，时间越长，DNaseI的nick越多，片段越短 |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起，
加到DNA里面温浴一下就好了。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 37 好的，
请问你用的protoco是啥 啊？
你在哪个公司定的biotin的引物啊？
能拉下超过20种的蛋白么？
除了western检测外，能不能用MS？ |
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b******e
发帖数: 3348 | 39 除了用sds-page外，高盐和低pH是不是也有效果，查了一下网上，有篇文章说过低的盐
好像也能破坏biotin-strepavdin的binding.彻底搞糊涂了。
谢谢！ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 40 Tyramide Signal Amplification Kits有的是二抗直接连HRP，有的又加了中间一步，
就是streptavidin和Biotin相结合，后者是一对一的关系，又没有放大信号，那么加这
么一步目的何在呢？ |
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x*****e
发帖数: 309 | 41 "后者是一对一的关系，又没有放大信号"?? 得看你的蛋白被标记了多少个biotin吧. |
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s**********e
发帖数: 2888 | 42 需要合成一个phenolic compound（苯环上羟基）的biotin衍生物，用DCC，溶剂DMF，
有什么需要特别需要注意的吗？
比如，所有的反应物需要额外的干燥？ |
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s******s
发帖数: 795 | 45 想研究protein A与B/C/D等的相互作用。
因为没法（或者很难）把蛋白A偶联到sepharose beads上，但是有commercially
available biotinylated protein A可以直接买（sepharose conjugated with
streptavidin当然也有卖），所以计划通过streptavidin+biotin搭桥，间接把protein
A
结合到sepharose beads上（sepharose-streptavidin + biotin-protein A），然后装
填柱子，然后apply protein B/C/D。
从来没做过avidin+biotin相关的实验，请问有朋友做过类似的么？streptavidin+
biotin的结合够强壮么？
假设 protein C可以与protein A结合，最后形成sepharose-streptavidin + biotin-
protein A + protein C。在wash和elute的时候，有特定的或者通用的条件可以
1。wash掉非特异结合的其他protein
2。特... 阅读全帖 |
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m******1
发帖数: 19713 | 46 唉！都怨我今天太闲了。。。
其实这个帖子多处存疑：
1。我去彩虹版看了，被封的是daesung，也就是这个帖子的楼主，而后来没完没了的却
是biotin。然而daesung和biotin的IP地址明明是一样的，并且这两个ID的说话风格、口气
完全一样，根本就是一个人。
2。biotin一会说daesung是拉拉，一会又说是直人。
3。既然biotin说daesung是拉拉，可是daesung说到同性恋却说“你们”同性恋，好象
她自己根本就不是同性恋。可是biotin却明明说daesung是拉拉。
ANYWAY，你要是不问，我也就不说这些了。我也是太闲了，全当写出来给你们解闷儿吧。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 当然是酸性的蛋白容易有pH 问题啦。哈哈。
另外，你的biotin bead 里的残留液如果很酸的话也会带来问题。
又另外，你的biotin bead 里有没有类似guanadine or DMSO 这种东西？你是用什么东
西来
洗脱biotin的？ 因为在我的印象中，单纯的SDS-buffer 是不能充分打开biotin-
stravadin
的结合的。 |
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L****e
发帖数: 499 | 48 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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L****e
发帖数: 499 | 49 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 50 估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。 |
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