w******e
发帖数: 1187 | 1 thx a lot! probe是某蛋白的aptamer pool，ms比较specific，不过anything
could happen hehe。anyway, I appreciate the info:) |
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s******s
发帖数: 13035 | 3 打算用biotinylated的RNA probe做一些检测蛋白、核酸相互作用的实验， 加热revers
e crosslink以后
需要用beads把这些RNA probe和直接相互作用的核酸除掉，但是不想碰那些pull-down下
来的蛋白和其他核酸。
Anyway, 简单说，就是用什么浓度的什么detergent可以解决掉蛋白/蛋白和蛋白/核酸的
interaction,
但是不影响核酸/核酸以及biotin/avidin的interaction？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 NO, I mean using 2M tris to disrupt the binding of protein but not the
binding of DNA or biotin-avadin
1M |
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w*****g
发帖数: 20 | 5 想做转录因子的相互作用蛋白。
不太想做酵母，因为怕说服不了老板，老板担心酵母污染，此外实验室是开发的实验室
，一个大房间有好几个实验室。
有人用过biotin做tag拉蛋白吗，效果如何？
谢谢 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 6 我做过biotin-tag膜蛋白效果很好。忘记是pierce 还是bio-rad的了。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 怎么recycle啊？streptavidin-biotin的binding很紧的，PCR都掉不下来，要洗下来除
非吧streptavidin denature了，可是那样一来不就没法recycle了？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 8 I agree:) the half-life should be ~10days, so if you add 100X excessive
biotin you might be able to recover your DNA after a month? hehe
but I thought PCR should be good? remember reading somewhere
ppl use heating for elution.
anyway, probably not worth it (though I'm indeed curious:) |
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V********n
发帖数: 305 | 9 多谢楼上各位。查到一篇Nature genetics的paper做的类似工作。Biotin label或者直
接抽膜蛋白跑２D胶也是很好的办法。 |
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X***n
发帖数: 366 | 10 If you are interested in chemical conjugation, you can try sodium
periodate oxidation then biotin-x-hydrazide labeling. It can only
label 3'-end. |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 最简单的biotinylated oligo往avidin NP上conjugate，yield巨低。。。
请教biotin-avidin interaction 会很挑buffer/etc condition吗？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 by other methods you mean other than biotin-avidin? I chose this
as I thought it's the easiest...
I didn't know that... do you know the reason ? thx! |
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y******8
发帖数: 1764 | 13 直接合成不是更好吗？
不太清楚你的oligo是什么性质的。加Biotin-T并不是很有效的反应，一般都还要再PCR
扩增。如果做imaging，要用多级反应放大信号。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 14 是这样的：我的RNA是2'-F modified aptamer，80base左右，据说找公司合成
很贵（不过也没问过）。我现在加biotin是用kit加在3’end。即使找人合成
也只敢往5’/3’上加，加到中间怕破坏结构：（
PCR |
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y*****1
发帖数: 73 | 15 you have to biotin label the antibody (or peptide) you want to use |
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o****e
发帖数: 1011 | 16
把这个interacting peptide的一端延长出去接个biotin；（尽量选择“不影响该
peptide和你要测的蛋白之间的相互作用”的一端）
选择使用Streptavidin （或NeutrAvidin） Coated的Plate，你的biotinylated
peptide应该能接到其表面上。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 17 想试试用aminoallyl-GMP在synthesize RNA的同时在5'加amine group，方便
下面做各种conjugation(with NHS ester of fluorophore/biotin)，不知有
什么注意事项没有？amine group应该很active 吧？用urea PAGE这种harsh的
条件purify会不会有问题？
多谢！ |
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h*****o
发帖数: 342 | 19 you can conjugate FITC to your molecule, and use the anti-FITC antibody to
detect it (antibody available from Vector Lab). FITC is also detectable
under any epifluorescent microscope. |
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w******e
发帖数: 1187 | 20 thanks! I'm doing cy3 now, which seem to have an ab also. just want to
find whether there is better alternatives hehe.
BTW, have you used those anti fluorophore Ab? can it achieve nM affinity
as other Abs? Thanks! |
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h*****o
发帖数: 342 | 21 I don't know if it is nM affinity. You may find out from Vector's website. I
used it for immunohistochemistry and it is very strong antibody. |
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w******e
发帖数: 1187 | 22 thx a lot for the infomation:)
I |
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w******e
发帖数: 1187 | 23 thx, but my 5'end would be occupied by a biotin-GMP already, so
I need to use 3'end:( |
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I**l
发帖数: 74 | 24 Phos-tag！！！
磷酸化蛋白特异性抗体，不分氨基酸，有biotin连接的phostag，可以做WB，也可以做
纯化。 |
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b******k
发帖数: 1874 | 25 I am writing to ask for help.
I am using Miltenyi anti-NKp46-biotin-bead- MS column kit. The first step is
to get splenocyte from spleen by gentlMACS without enzyme treatment. A very
simple protocol, just put spleen into the PEB buffer and let gentleMACS run
m_spleen_01 program once, and filter, spin, aspirate, resuspend the pellet.
The problem comes from the resuspending process. The small tight pellet will
produce(or contain) big clump that is almost impossible to break when 10 ml
PEB buffer i... 阅读全帖 |
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n***g
发帖数: 5027 | 26 本人没有这方面的经验，有没有好的建议和protocol呢？
比如，DNA大小？
O(∩_∩)O谢谢 |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 没看懂。你想用啥pull啥？用DNA probe去pull其他东西？ |
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o**4
发帖数: 35028 | 30 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 你到底是用DNA pull啥？只要DNA，多长都可以，不过毫无意义。
要pull蛋白，20bp估计太小了吧？要pull其他的DNA，20bp不够
牢，一般用LNA,PNA一类的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 33 一般比较段的就用引物了，比较长的，尤其要求结合比较牢的，可以
nick translation |
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o**4
发帖数: 35028 | 34 O(∩_∩)O谢谢，就是不知道用多长的DNA做pull down合适。 20bp是不是太小了？ |
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o**4
发帖数: 35028 | 36
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~这个怎么做啊？引物最长能合成多长啊？ |
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W****C
发帖数: 1937 | 37
20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ |
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o**4
发帖数: 35028 | 38 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊？
O(∩_∩)O谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 40 太感谢了啊，
我这有个enhancer，只有20bp，
你说我是用这个20bp去拉蛋白呢？还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢？
另外，多长最合适呢？
O(∩_∩)O谢谢 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 42 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话，谢绝追杀。
如果你知道你的binding motif是什么序列，在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
个binding motif的二级结构。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 44 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧？
比如100bp怎么样？
另外，使用单链DNA做pull down好？还是应该用双链呢？
O(∩_∩)O谢谢 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 45 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起，pull down效果如果不好再用长片段吧。
至于是单链还是双链，得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 46 那还是用双链？这个更加接近in vivo吧
“越长未必越好”，怎么说啊？
吧。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 47 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么？你的oligo越长，结构就越复杂
，最后pull down下来一堆别的东西怎么办？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 49 哦。
那短片段也可以做Mutant啊。短片段可以直接合成，不是容易点么。你要直接上100bp
的也没啥就是了。我说过我没做过pull down，所以就是纸上谈兵而已。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 50
不用１００吧 越长不是越容易有２级结构。 我做ＮＦＫＢ的 就用２０多个 |
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