s****9
发帖数: 932 | 1 Of course. Many people even put an artificial exon-intron-exon in front of
ATG to increase expression. |
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c*****g
发帖数: 66 | 2 1）肯定是pri好，miRNA的preprocessing应该是context dependent，比如说有些
intronic的miRNA的mature是coupled with splicing的。当然，你可以minimally
define可以被细胞preprocess的pre-miRNA，那肯定会更简单一些，这个是不是叫shRNA？
2）关键的问题是你的RNA包含了你需要的所有序列吗？如果是，不就是一串DNA吗，什
么做模板没区别。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 4 thank you, it's a good point, I would try it. extract DNA and PCR my target
gene.
the question is I tried several cDNA, And all they have intron like
structure?
still
between |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 原始阶段的
RNA 如选用T 而没用U 的话
真核生物 就不可能选 poly(A)(+) tail 了
由于 poly(A)(+) tail 早在 那以后很快由于
RNA editing within post-transcriptional event 中出现Chaotic/Random/Tight
binding T==A 被淘汰了 或成了SF movie里的allian DNA喽 (possibile)
正好有篇今年的paper
Nat Biotechnol. 2012 Feb 12;30(3):253-
Comprehensive analysis of RNA-Seq data reveals extensive RNA editing in a
human transcriptome.
by Peng Z. et al
Abstract
RNA editing is a post-transcriptional event that recodes hereditary
information. Here we describe a comprehensi... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 6 negative control primer的选择还是很tricky的.
同样的IgG和Ab的sample,
有些negative ctrl的primer就很好，有些primer不管怎样都会有signal，很恼火。。
。你可以试着选择intron的地方设计primer试试看。
至于结果分析，你可以去找几份最新的ChIP的paper看看，
用qPCR sample（IgG和Ab）的CT值和1%input DNA CT值，
算出分别是1% Input的多少倍。然后再算ab vs IgG有多少倍的enrichment |
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 推断
不会影响IRES dependent的translation
如果第一exon 比较短 后边有一个长的intron的话
if unlucky 建议你把Cre or similar target 放在后面的外显子里。比如，第2，3个
外显子。 |
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a*****g
发帖数: 543 | 8 RT-negative 值太高；
很像是你的plasmid contaminate.否则要靠genomic DNA达到你的Ctvalue挺难的 （当然
你的primer应该intron spanning...最好是TaqMan based method)
建议换水（买水， 买新的primer-probe mix),借别的lab的枪, 用filter tips...
sample |
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s*****a
发帖数: 59 | 9 恩，isoform 1的primer是intron spanning的，所以不会扩增gDNA，但是会被用来做
cloning的plasmid污染。我现在已经准备换掉全套实验用具了，还有换别的实验室做。
当然 |
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a******8
发帖数: 56 | 10 In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
PCR for 3'UTR or others)? Good luck. |
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u*********1
发帖数: 2518 | 11 关于治疗：
我表示非常无奈。这是绝症中的绝症，而且是最没人道的绝症。
所以家里能做的，就是好好调养好好护理，争取能延长生命。不抛弃不放弃。
关于研究：
大部分的研究成果还是在10%的familial ALS，找到一些基因。但SOD1也不能解释全部
的FALS。而这些FALS的基因突变，只能在2%的很少一部分的SALS的序列里找到。也就是
说，90%以上的病人，我们对基因组上的突变是一无所知的。
最郁闷的是，哪怕是FALS，也发现了很多不同的mutation。感觉现在是在一个一个的打
靶，碰运气找到一个基因就是一个。最后感觉这个疾病和乱七八糟的各种pathway都有
关系，就是我们永远搞不清楚到底怎么回事。
ALS的病人少，而且发病死亡快。所以找到大规模家族的样本，采样测序什么的很困难
。同样，GWAS的研究的样本也要少很多，所以power很低。而且纵然是GWAS的研究目前
也是针对白人。
当然也有振奋人心的新闻，一个是cytoplasmic inclusion of ubiquitinated TDP-43
存在于几乎所有的ALS sample里，也就是找到了syndrome mark... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 12 以后southern不用切么？
我也没造过老鼠，都是听周围造老鼠的说的。
我们用的floxed的老鼠两个loxp中间800bp左右，exon只有不到400，剩下的400是两边
各一段intron。两边都有几个酶切位点，不过我们的不在 5,UTR，在不在splicing
site就不知道了，从没有任何表型没有蛋白质降低来看应该是不在splicing site。
关键老鼠这玩意儿没见到最后跟cre交配的KO谁也不敢说没问题啊。 |
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r*******y
发帖数: 48 | 13 1. floxed 300 bp should not present any problem for recombination;
2. introducing a disgestion site is a good and reasonable design for future
southern verification, if there is no endogenous restriction site(s)
available for southern strategy;
3. you should pay more attention to the design of the arm length. Based on
my experience, over 5000bp/arm is recommended; shorter than this will reduce
the specific recombination efficiency, although some reports also suggested
that a shorter arm also wor... 阅读全帖 |
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W*********n
发帖数: 775 | 14 大家好：
现在已克隆出基因编码区的全长cDNA, 想设计Mophilino片断，就得知道此基因mRNA起
始编码区上游25bp的序列。现在有基因组序列， 可否认为基因组序列中起始编码区上
游的25bp也出现在转录后的mRNA序列中？
5’UTR会不会有Intron?
谢谢！ |
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c********r
发帖数: 189 | 15 这是个很有意思的问题。可能是各种调节吧。好比说盖座楼，盖完之前，楼外罩着很多
东西，脚手架，烂七八糟的，但是盖好之后，就要把这些东西清掉。或者重新组装。
看起来是浪费资源，其实是必需的吧 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 首先，你设计的时候考虑到了基因组上的intron 了么？
第二，一般来说，基因组做底物很麻烦的，一个是量的问题，第二就是特异性的问题。
所以很少有人这么做。
但是如果非要这么做不可的话，必须放很大量进去（你自己算算摩尔数，要放到和你放
的plasmid 差不多的量得放多少，不要盲目用ug 这些重量单位，那个不算数的） |
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j*****q
发帖数: 82 | 17 偶是定量copy number，用的直接是gDNA做template。所以没有intron的问题。
而且做的相对定量，所以底物的量不是问题，底物会有一个剃度的。
还是谢谢阳光jj的回帖。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 18 引物设计有问题，可能落在intron里面了
或者是alternative splicing，你们检测的那种isoform不占大头 |
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c********r
发帖数: 1125 | 20
炸药颁错奖也不是一个两个了。。。Transcription regulation,oncogen,DNA,intron,
GFP,泛素只是其中一个吧。
有的是因为不是最早的那一个，尽管贡献大也不被认可，有的是得罪人，走穴不够。。。
只记得当年一堆这个领域的大牛联名在science上发表了一个署名的为varshy叫屈的文
章，我记得题目是“varshavsky's contribution"。 |
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d*****n
发帖数: 166 | 21 哦，谢谢，看了，原来是经常出错的化学奖。那就不奇怪了。
intron,
。。 |
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i********f
发帖数: 206 | 23 mitochondrial splicing 是发生在比较低等一些的物种么？
好像人的mitochondrial里面没见有intron啊。 |
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j***x
发帖数: 1469 | 24 A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major
intron of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene
SD Gillies, SL Morrison, VT Oi, S Tonegawa - Cell, 1983 - Elsevier
please send to l************[email protected]
thanks in advance |
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 Plant
There is reason to think that mRNA degradation sometimes starts with the
action of ribonuclease III, an enzyme specific for duplex RNA, which could
cleave in stem-loop structures and create sites for exonucleolytic attack.
RNase III is actually involved in the maturation of certain phage mRNAs as
they undergo posttranscriptional processing, but this involvement is not
known to occur with bacterial mRNAs.
PMID 17693527
Watkins KP et al.
A ribonuclease III domain protein functions in group I... 阅读全帖 |
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j**W
发帖数: 89 | 28 见新图并更正。
Sequencing was done with P2, which is within Exon 1. The resulting sequence
include region A (part of Exon 1 starting from P2 to before NotI site)
followed directly by region C (Intron 1 after the AscI site). NotI and AscI
are the enzymes used to put the construct together.
现在清楚了吗？ |
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u*********1
发帖数: 2518 | 30 楼主，对于CNV，simply forget it
貌似只有DGV是比较靠谱的NIH-sponsor的数据库，但我从来不会用，也不知道怎么用。
你别说CNV-phenotype了，就连CNV本身就没啥靠谱的数据库。
或者说的更明白点，以目前的sequencing技术条件和后期数据处理，CNV
identification和validation几乎不可信。主要是sequencing reads太短，而CNV（包
括copy number variation，del，dup，inv，translocation等等）根本无法通过这么
短的reads被identify。。。其实别说CNV了，就连2bp的indel都很困难，因为比如
intron-exon boundary有时候会有一连串的TTTTTT，那么你要确定到底是多了两个T，
还是少了两个T，是很困难的。
1000 genome project目前有indel和large deletion的database。1000G最后present出
来的indel/deletion我是比较相信的，但问题是他们present出来的只是genome里... 阅读全帖 |
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D****g
发帖数: 275 | 31 It also depends on what you are going to do with those RNA. If you want to
do Northern blot, No; if you want to do RT-PCR, probably you should; For RT-
PCR, you can design primers to cover intron to amplify the mRNA to avoid the
DNase treatment, or you can use some specially kit to amply cDNA but not
genomic DNA. Good luck. |
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b*********8
发帖数: 44 | 32 感谢回复！
我做的是植物的。 我现在想过表达一个miRNA, 已经知道他的stem-loop序列，也blast
到了他的部分genome序列，但没找到cDNA序列。我如果直接根据genome序列，在这段
stem-loop序列两边各加上100bp边界序列做过表达，可以吗？我担心这段边界序列不会
正好在intron区吧,会不会影响发夹结构的形成？ |
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v***a
发帖数: 1242 | 33 请见附图：
1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。 |
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C**S
发帖数: 522 | 34 "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。 |
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m***o
发帖数: 272 | 35 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
,统统处理一下,没坏处. |
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v***a
发帖数: 1242 | 36 多谢。打算以后都要用Dnase处理。
intron |
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l**********1
发帖数: 5204 | 37 key words:
5fC; 5 caC; pre-mRNA splicing; Pol II; hetrochromatin or H4K20
cited from
Nat Struct Mol Biol. 19: 1061-4. (2012).
New functions for DNA modifications by TET-JBP.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23132381
>the ability of 5fC and 5caC to decrease the transcription elongation rate
of Pol >II may facilitate the interaction of Pol II with diverse
transcription elongation factors, chromatin regulators, histone-modifying
enzymes and factors involved in pre-mRNA splicing. Shukla et al.34... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 38 我们要区分清楚两个概念：
a. RNA-seq发现一些基因的transcription level有变化
b. 通过yeast hybrid，chip-seq等等我们得到一些证据证明某个TF是bind到这个基因
的某些element的
我只想说，transcription level的调控是非常非常非常复杂的，远远不是promoter那
么简单；你其实可以直接去看ENCODE project对基因noncoding区域的annotation，有
很多TF是和intron结合的，同时被很多相隔很远的enhancer调控（chromatin
structure比如looping）；所以transcription level有变化绝对不能就说是promoter
被调控导致表达量有变化
当然我也不会完全信ENCODE的数据，1. 我相信还有很多其他的罕见的TF会binding到这
个位点，但没有被数据库cover，2. 纵然有证据证明一个TF binding to loci，也不代
表就一定有biological function，这个需要下游证明
以上还是基于最简单的考虑，没有考虑tissu... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 39 predicted miRNA target实在是太多的false positive了；TF binding也是一样
而且我记得在好几年前miRNA bind 3'UTR to suppress mRNA expression的经典theory
就被颠覆了，miRNA可以bind到5‘UTR，CDS，intron，intergenic等等，可以increase
可以decrease表达量，这种研究应该太多了吧
现在都没人单纯做miRNA了吧？都是做lincRNA，或者miRNA和TF搅合到一起的复杂机制
。。。 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 40 我做ALS-FTD相关的，所以先从C9orf72说起；C9orf72里的repeat expansion都发现两
年了，但好像到现在我们不仅搞不清楚repeat expansion到底是如何作用的（除了那个
可能的non ATG translation），也搞不清楚C9orf72到底是什么功能。。。所以还是在
用C9orf72这么ugly的名字。不知道有没有什么搞C9的内行人士来说说。。
还有一个长期困扰我的八卦问题。2011年neuron上最早报道C9orf72 expansion的两篇
文章。。。我觉得这么重大重大的发现足以发science nature，为何会只发在neuron上
？难道是两个组当时在竞争？或者有什么别的内幕？
再推广到整个的neurology；很多很多neurological disorder都是repeat expansion导
致的；repeat expansion听起来很fancy，平白无故的增多了1000个repeat，别说
coding region或者promoter了，哪怕在intron区域我们也会很“自信”的认为比如会
影响splicing等等。... 阅读全帖 |
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A******y
发帖数: 2041 | 41 Google Friedreich's ataxia. The repeat expansion is in the first intron.
The transcription factor falls off. If you have 50% of mRNA, you are fine (
carriers). However, if you have two expansions, you are screwed. If we
cannot cure this, we can cure any genetic disease considering the gene is
normal. Huntington's disease is also a repeat expansion, but even the mRNA
with expansion is toxic.
在 university1 (guang) 的大作中提到: 】 |
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i*********0
发帖数: 915 | 42 intron几十个碱基，可能少了一点，我一般都是至少在exon留下50bps的距离，再插入
loxp位点。 |
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l******u
发帖数: 936 | 43 http://investor.illumina.com/phoenix.zhtml?c=121127&p=irol-news
Illumina’s MiSeqDxTM Receives FDA Premarket Clearance with Two Cystic
Fibrosis Assays and Universal Kit for Open Use
Premarket Clearance is an Industry First for a Next-Generation Sequencing
System
SAN DIEGO--(BUSINESS WIRE)--Nov. 19, 2013-- Illumina, Inc. (NASDAQ:ILMN)
today announced that it received premarket clearance from the U.S. Food and
Drug Administration (FDA) for the MiSeqDx system, the first high-throughput
DNA sequencin... 阅读全帖 |
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l*******i
发帖数: 153 | 44 Bless宝宝！
请问楼主做的是exome-seq吧？宝宝父母也都测了吗？近亲有遗传史吗？如果没有，父
母均正常的话，很有可能应该就是de novo mutation了。de novo mutation在新生儿中
的发生率非常低，而且80%以上位于exon。
如果exome-seq没有发现de novo mutation,那说明mutation可能位于gene调控区，甚至
intron，上GWS或许可以发现某些异常，但是代价比较高昂。
我想说的是，像这样的基因缺陷病（姑且这么说吧，宝宝不一定是），最后即使找到了
defect的gene，对治疗可能也没你所期望的帮助。因此，我觉得，楼主现在首先要做的
是应该明确诊断，对症治疗是关键，首先把宝宝的病情控制住了，尽量减轻疾病带来的
伤害。
MCT |
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W*********n
发帖数: 775 | 45 真核生物的基因 （转录出来的是mRNA），打算看一下调控它的转录因子（
transcription factors）,请问是否它的转录因子结合位点一定在转录起始位点上游？
以我的知识我认为：基因转录出来是mRNA, 所以转录酶是RNA聚合酶II，而 RNA聚合酶
II 的转录因子应该是在上游的（不知道这么说是否正确？）。
因为我的目标基因的翻译起始位点在第二个预测的Exon的中部，第一个Exon（500bp）
和第一个Intron（4500bp）比较长， 所以我想知道分析这个基因的转录因子，应该从
第一个Exon之前分析呢，还是应该从翻译起始位点之前分析？
谢谢！ |
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T****u
发帖数: 424 | 46 of cousre not.
usually there are TF in first intron,and sometimes longrange TF. |
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l********e
发帖数: 415 | 47 如前面版友所说，很多都在intron，不一定要upstream
一般情况下，看看TSS(transcription start site)前后20-50kb就差不多了。
结合evolutionary conservation和histone marks看。
题外话：
染色体间的转录调控，这个假说的确是存在的，不过好像还没有很充分的证据。 |
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W*********n
发帖数: 775 | 48 谢谢！
您说的“ 一般情况下，看看TSS(transcription start site)前后20-50kb就差不多了
。转录起始位点后面的20-50k处，可能包括基因的所有intron 和Exon了，如果在这些
序列中发现转录因子结合位点，也可以认为它们参与了该基因的转录？
我最转录这块了解不多，现在对一个基因的转录调控比较感兴趣，所以想查查看看那些
转录因子调控它。希望专业人士给与指导。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 49 谢谢啦！如果我看到一个gene intron表达是在control 和mutant里面比较一致，但是
检测exon的水平有差异的话，是不是表明，这个gene的转录后调控出了问题？ |
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m******u
发帖数: 12400 | 50 能确认这是pre-mRNA，而不是alternative splicing产物？若是后者，这应该算是成熟
的mRNA。
严格意义上pre-mRNA是没有poly（A）的，更严格意义上说，是没有pre-mRNA这个东西
的，因为转录过程中，帽子已经加上了，前边的intron已经间接了。
（当然，因为细胞内的所有的代谢过程是会出错的，很短很小的转录本（含一或两个内
含子的）肯定会有没被剪接的内含子，在外在变现就是有poly（A）tail的 pre-mRNA）。
发信人: shakuras (doskey), 信区: Biology
标 题: Re: premRNA也有polyA tail么？
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Feb 25 10:47:25 2014, 美东)
有啊。有时候会克隆出来 |
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