B******o
发帖数: 496 | 1 pubmed上有不少啊。不过需要注意的是，你的lentiviral vector的promoter最好是EF1
或者PGK的，CMV之类的promoter在hES会被silence掉。所以如果你看到某篇文献用CMV
之类的vector然后讨论说MOI多少的时候效率有多高，基本是忽悠。据俺所致，比如像
su-chun zhang的lab用lentivirus还是需要有建立稳定细胞系的过程
另外，如果要enhance transduction, 除了polybrene，可以再加上spinoculation |
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g******g
发帖数: 63 | 2 偶研究夫人是microRNA的lentiviral vector
GFP是vector的标记蛋白
请问
1.现今有任何方法可以测试细胞中被knock down 或者know in 的microRNA的
expression吗？QRTPCR不行。
2.为什么在转染几周后，GFP的表达和刚刚转染的时候的表达强度下降30%-40%？
谢谢 |
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e******n
发帖数: 193 | 3 invitrogen
HiPerform LentiViral Expression kit
cat No SKU K531000 |
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n********e
发帖数: 19 | 4 lentiviral也问题不大，我就被扎到过，虽然理论上很安全，但是还是担心的做了一年
的HIV血检，没事。之前听说有人被扎到过活得病毒，也没事。 |
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T****r
发帖数: 4006 | 5 shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染.... |
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m*****n
发帖数: 760 | 6 package好的virus有多大可能会感染操作者啊？
觉得这个东东跟HIV就是差不多的一回事啊？
而且中间的gene of interest也不是什么好东西。
这要是感染上了，那不一辈子就完了？
请有作此类实验经验的给说说吧。
也请大家原谅我的无知。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 7 我的理解是, 一般你用的病毒都不能复制自己, 而且你也不会注射到自己身上, 顶多手上沾一点, 所以不必很担心. |
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F******p
发帖数: 2099 | 8 它不能复制,所以如果你不幸伤口接触,粘膜接触而感染,仅存在于被感染的细胞genome
里. gene of interest就另说了. |
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s*******g
发帖数: 3332 | 10 被感染的这个细胞被随机整合插入的virus破坏了自身某个正常的tumor suppressor的
表达呢？
genome |
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C*****h
发帖数: 926 | 11 还是要小心。
虽然病毒不能复制，但是如果titer很高的话，那么每一微升，就有可能上万个
病毒，就这一万个病毒感染到你的皮肤上，都有可能导致皮肤细胞癌变，尤其是
病毒上克隆的基因是致癌基因的话。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 12 如果不放心：
带2层手套，穿一次性的LAB COAT，戴N95口罩，戴MASK……
大家用的LENTIVIRUS其实没有HIV恐怖吧……
HIV 是3级LAB了……
LENTIVIRUS的VECTOR，1-2级……
我以前做过一些……开始怕怕，后来就麻木了，汗…… |
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n******d
发帖数: 1055 | 13 既然能感染细胞，就能感染你，就能把基因转染给你。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 14 I would like to make pGIPZ lentivirus to knockdown a gene in T cels. Do not
know how to package the virus. Thanks |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 Lentivirus is kind of tricky. If you never did it before, I suggest you to
talk to your boss, and then find someone who has the experience to help you.
not |
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s********l
发帖数: 58 | 17 我们用过，包病毒蛮常规的，就是表达了不work，无法knock down 基因表达。 |
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o**i
发帖数: 1165 | 18 lentivirus RNAi level II就可以了 |
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D******9
发帖数: 2665 | 19 想在LEUKEMIA的细胞系中用lentiviral shRNA KNOCKDOWN一个基因， 打算用puromycin筛
选，跟贴壁细胞一样做么？ 死细胞怎么除去呀？ 每次加新药都要先离心吗？谢谢 |
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d******r
发帖数: 124 | 20 我神经元养在波片上，然后把波片倒扣在胶质细胞层。如果我用lentivirus转染神经元
，是不是得把波片翻过来？翻过来保持多久合适？太久了好像不利于神经细胞健康生长
，但是如果太短的话，估计病毒颗粒还没机会和神经元“亲密接触”。谁有类似经验吗
？？ |
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d******r
发帖数: 124 | 21 顶一下。
为啥的我的问题总是没人回答
是不是太简单了...
大牛都不屑于回答...:((( |
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d******r
发帖数: 124 | 23 没有的
波片和astrocyte layer之间有空隙，这样神经元并不和胶质细胞有直接接触。 |
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F******p
发帖数: 2099 | 24 波片和astrocyte layer之间有medium, virus加到medium里面，virus自然会find its
way. |
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a******n
发帖数: 392 | 25 如果要在细胞系里同时knockdown两个基因，怎么选择RNAi的方法阿？siRNA,
lentiviral shRNA? 效率哪种高？ |
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a******n
发帖数: 392 | 26 多谢。如果用lentiviral shRNA，infection 之后几天可以用puromycin测定
transduction的效率？ 在加puromycin之
前，需要把细胞重新plate吗？ |
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b*******0
发帖数: 507 | 27 In Vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Nondividing Cells by a
Lentiviral Vector
science, 272,263-267 (1996)
send it to b********[email protected]
Thanks a lot! |
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T**********r
发帖数: 287 | 28 I bought the bacterial stock from Thermo Scientific Open Biosystems
Expression Arrest GIPZ Lentiviral shRNAmir. How can I check whether the
shRNA is a validated one from the sigma website? Thanks a lot!
validated SH |
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f****b
发帖数: 314 | 29 "The openbiosystems lentiviral vector includes a tetracycline inducible
promoter that produces tightly regulatable RNAi."
虽然我没有细看，但显然不是CMV那么简单的事情。你自己的实验，你自己要看清楚。 |
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T**********r
发帖数: 287 | 30
inducible
多谢提醒，不过你提到这个是openbiosystem的另外一个系统TRIPZ，的确是用
tetracyline
induce的。
Open biosystem有两种shRNAmir系统实现knock down:
a.Stable knockdown: GIPZ；shRNAmir is constitutively expressed as a
polycistronicvector that codes for tGFP, puromycin resistance
marker (Puror) and the shRNAmir.
b.Regulated knockdown: pTRIPZ,也是你提到的。
见链接
http://www.openbiosystems.com/collateral/rnai/pi/Lentiviral%20shRNAmir%2
0for%20Stable%20and%20Regulatable%20RNAi.pdf
再次真诚感谢，有了质疑，才能避免将来实验走弯路。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 31 Joke of the day or what?
there is not a most shameless but more shameless!
Results: 33
1.
Viable fertile mice generated from fully pluripotent iPS cells derived from
adult somatic cells.
Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T, Hao J, Wang X, Wang L, Zeng F,
Zhou Q.
Stem Cell Rev. 2010 Sep;6(3):390-7.PMID: 20549390 [PubMed - in process]
Related citations
2.
Production of mice using iPS cells and tetraploid complementation.
Zhao XY, Lv Z, Li W, Zeng F, Zhou Q.
Nat Protoc. 2010;5(5):963-71. Epu... 阅读全帖 |
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l*****m
发帖数: 122 | 32 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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h********r
发帖数: 519 | 33 Transcriptional responses in honey bee larvae infected with chalkbrood
fungus.
Aronstein KA, Murray KD, Saldivar E.
BMC Genomics. 2010 Jun 21;11:391.PMID: 20565973 [PubMed - indexed for
MEDLINE]Free PMC ArticleRelated citations
2.
Proteome profile and lentiviral transduction of cultured honey bee (Apis
mellifera L.) cells.
Chan MM, Choi SY, Chan QW, Li P, Guarna MM, Foster LJ.
Insect Mol Biol. 2010 Oct;19(5):653-8. doi: 10.1111/j.1365-2583.2010.01022.x
. Epub 2010 Jun 7.PMID: 20546039 [PubMed - ... 阅读全帖 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 34 ☆─────────────────────────────────────☆
timeonly (圆满) 于 (Thu Dec 23 15:28:05 2010, 美东) 提到:
发信人: desesperado (Estoy), 信区: Military
标 题: 方舟子谈蜂蜜：基本上是高浓度的糖
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 23 12:11:10 2010, 美东)
http://discover.news.163.com/10/1223/10/6OJ4ABLE000125LI.html
核心提示：方舟子认为用人工的方法，可以制造出一种与蜂蜜一模一样成分的东西。其实蜂蜜并不神秘，基本上就是高度浓缩的糖。蜂蜜除了水分，剩下的几乎都是各种各样的糖。蜂蜜的成分会有变化，但大同小异。
中青在线-中国青年报12月23日报道 什么是蜂蜜呢？这个问题似乎很简单，是蜜蜂采集花蜜酿造出来的甜味物质。蜜蜂把花蜜吸到它的第二个胃 ——“蜜胃”里面，在那里进行消化（让花蜜中的蔗糖大部分转化成果糖和葡萄糖），回到蜂巢吐出来，让水分蒸发、浓缩，这样，原来
含水分大约 80%）... 阅读全帖 |
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z****g
发帖数: 3340 | 35 大家都用什么样的，homemade or any commercial available. 不是用于iPS, 主要是
用于primary cells overexpression. |
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z****g
发帖数: 3340 | 37 这个看起来比较毛，还必需用它的packaging system. 竟然要传5个plasmids. |
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a********k
发帖数: 2273 | 41 关键是只想用一个荧光marker，这样FACS才有足够的光谱给二抗。
原代细胞就养几天，没法筛又。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 42 恩，找了一圈，发现很多人cotransfection几个，很多人做tandem，也有很多人用几个
cassette表达的。
vector |
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w****u
发帖数: 1078 | 43 最近试了几次，使用spin的方法，效果都不好，效率特别低（5%左右）。请问谁有
working protocol.多谢。 |
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d*p
发帖数: 534 | 44 同学，咱们做的课题怎么相似啊，等我把文章发了再告诉你，嗬嗬！ |
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w****u
发帖数: 1078 | 45 protocol最好提前share一下，因为内容不相关，不会涉及到你的成果的。 |
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y*********r
发帖数: 78 | 46 I had the same problem before with murine primary T cells. Probably
retrovirus is better. |
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z******e
发帖数: 3 | 47 对retrovirus转human oncogene一直有疑虑，怕不安全。 |
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w****u
发帖数: 1078 | 49 CD4+ T cells.Any new idea? |
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d*p
发帖数: 534 | 50 我这方法在CD8上还行。 在CD4上面没效果，你试试retronectin吧。 |
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