q******g
发帖数: 3858 | 1 stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。 |
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x******o
发帖数: 76 | 3 试过DH5a也做不出来，而且DH5a难道不是不适合做unstable clone吗？
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？ |
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M******g
发帖数: 152 | 4 sequencing is so cheap and easy nowadays.
I have cloned a 6.3 kb gene using Q5 pcr and seen no mutations. I love Q5
and gibson assembly. highly recommend them to you. |
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w*****t
发帖数: 179 | 5 Curr Gene Ther. 2011 Oct;11(5):350-62.
Integrase-defective lentiviral vectors--a stage for nonviral integration
machineries.
Staunstrup NH1, Mikkelsen JG.
Please send my emaill address: w************[email protected]
I appreciate it. |
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w*****a
发帖数: 437 | 7 谢谢楼上各位的回复！每人一个小笼包鼓励:-)
看来大家都觉得要重新做virus，那是不是要买lentiviral packaging kit来包装？哪
家的比较好用啊~
-80的virus，是不是可以浓缩以后试试，clontech有个浓缩病毒的kit不知好用不？ |
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j******i
发帖数: 939 | 8 我就说说我熟悉的领域基因编辑吧（虽然elife这方面发文很少）。现在热门的CRISPR,
最早的几片经典文章之一就是发在elife的，另外几片在Science 和 Cell。RNA-
programmed genome editing in human cells （2013年一月份）， 目前引用 144。最
近elife发了一篇关于蛋白运送ZFN的文章Targeted genome editing by lentiviral
protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases。马上Nature也
发了一篇mRNA来运送ZFN的文章。 |
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j******i
发帖数: 939 | 9 我就说说我熟悉的领域基因编辑吧（虽然elife这方面发文很少）。现在热门的CRISPR,
最早的几片经典文章之一就是发在elife的，另外几片在Science 和 Cell。RNA-
programmed genome editing in human cells （2013年一月份）， 目前引用 144。最
近elife发了一篇关于蛋白运送ZFN的文章Targeted genome editing by lentiviral
protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases。马上Nature也
发了一篇mRNA来运送ZFN的文章。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 10 Hum Gene Ther. 2001 Oct 10;12(15):1893-905.
Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors.
Kumar M1, Keller B, Makalou N, Sutton RE.
PMID: 11589831
Please send to [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,2),16)^r;s+=String.fromCharCode(c);}s=document.createTextNode(s);l.... 阅读全帖 |
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B******o
发帖数: 496 | 11 首先应该确认virus titer没有问题。如果titer很高，transduction效率低，可以加一
些辅助试剂polybrene之类的。如果还不行，在低速条件下离心，会显著增加感染效率
（请搜spinoculation） |
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j******i
发帖数: 939 | 12 不奇怪，macrophage是有名难转lenti的细胞。因为SAMHD1会限制其复制。 |
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z*******9
发帖数: 112 | 13 谢谢，我现在正在监测他在293T里的情况，
只是觉得这个也太Counter Intuitive 了， |
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s******s
发帖数: 13035 | 14 你看看GFP前面有没有独立的ATG能单独表达的？要么就是你的蛋白实在太不稳定了。
你有没有用GFP抗体做一下western看一下大小？
293T里面比较tricky。我的理解是这玩意儿根本不需要经过mRNA，直接就是病毒RNA表
达了。 |
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l***y
发帖数: 638 | 15 测个mRNA，看看有没有GFP的mRNA上还有没有目标蛋白序列连着，可能就是目标蛋白表达
太低，或者有毒性被select against了丢了只剩GFP了 |
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z*******9
发帖数: 112 | 16 谢谢各位的建议，
我首先监测了在293T trasfection时，蛋白的表达，IFA结果表明我目标蛋白表达良好
，基本是有GFP信号的细胞，目标蛋白都是表达的，
接着，我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot，这次两次监测的结
果都是阳性，我都能监测到目标蛋白（这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能
是抗体的原因）
不过，对细胞株的IFA又看到一个现象，我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合，我可以
观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号，或者反之，（重复一下，
我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)?
请问各位，这是不是经常出现的现象？ |
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v**********m
发帖数: 5516 | 17 2AA的linker在细胞内被非特异性剪切。gfp fusion常见的现象。 |
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j******i
发帖数: 939 | 19 现在其实只有三代，包括用来基因治疗的都是三代。如果没有U3 deletion的话，就是
二代。二代的特征是一共三个包装质粒，三代是四个质粒。 |
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V******t
发帖数: 444 | 20 只用两个包装的呢？
pMD2.G psPAX2
或者
pCMV-dR8.2 dvpr＋pCMV VSVG |
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j******i
发帖数: 939 | 21 那就是一代了。基本上是个HIV了，只是把膜蛋白和其他成分分开，一般做HIV的才用。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 22 两个质粒的是2代，3个是3代。
他说的4个的是所谓的4代，应该是有个tet-on控制。
一般都是用3个。 |
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B******o
发帖数: 496 | 23 为啥要用clontech的？ sbi的选择多很多啊，除非你一定要inducible |
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j******i
发帖数: 939 | 24 那请问一代的是什么？一个质粒😓？至少得把膜蛋白和其他病毒结构分开吧（
一代两个质粒）！否则就是HIV, 不是vector了。tet-on根本就不够分带的标准，就是
换了一个启动子而已，最多算商家的镢头。 |
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B******o
发帖数: 496 | 26 对的，addgene上也有一大堆，各种组合应有尽有。
packaging质粒，addgene上pax2那个效率不高，sbi或者sigma的都很不错 |
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r***e
发帖数: 2539 | 28 对，4代就是噱头。刚才google了下，还是5个质粒。
lenti最早是我们实验室开发的，现在也是用3个质粒的系统。 |
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j******i
发帖数: 939 | 29 这位老大，去掉的只是一些无关紧要的附属蛋白比如VPR, NEF. |
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v********a
发帖数: 646 | 31 Scientific Manager – Stem Cell (Job 34333)
Are you interested in pioneering Stem Cell Research? We are seeking a
Scientific Manager for the new Developmental Neurobiology Stem Cell
Laboratory. As the Scientific Manager you will lead collaborative research
projects with investigators in the Developmental Neurobiology Department.
The Scientific Manager will be responsible for:
· Developing new differentiation protocols aligned with the
research interests in the department.
· Modeli... 阅读全帖 |
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l*******i
发帖数: 153 | 32 这取决于你的载体的优点与A细胞在基础研究和临床应用中的重要性。
首先，与目前广泛使用的AAV，retroviral, lentiviral, transposon, episomal,
minicircal等gene delivery tools相比，你的vector有哪些优势：
转染效率如何？
安全性如何？
稳定转染的时间有多长？不会出现transgene silencing?
在deliver大于10kb的transgene cassette 有优势吗？
less immunogenicity?
操作简易程度如何？
成本控制怎样？
如果以上问题都是肯定的，特别是优于viral vector，那么你直接就上nature biotech
或nature methods吧。如果有一半问题是肯定的，那么PNAS档次的应该可以一试；如果
上述三分之一的问题是肯定的，那你就试试molecular therapy。
如果你能拿到病人的细胞，做个correction，在评价一下corrected cell的功能与
efficacy & safety profile，可以试试science tran... 阅读全帖 |
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t*******k
发帖数: 87 | 33 比较偏技术的文章，不知那位大侠有全文的权限
Biotechnol Bioeng. 2011 Mar;108(3):600-10. doi: 10.1002/bit.22968. Epub 2010
Nov 23.
Generation of stable, high-producing CHO cell lines by lentiviral vector-
mediated gene transfer in serum-free suspension culture.
Oberbek A1, Matasci M, Hacker DL, Wurm FM.
信箱 [email protected]
/* */
谢谢！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 请教行家：Feng Zhang的genome-wide Screening（CRISPR)后面的deep sequencing
对这个很感兴趣。读了几篇相关的文章和screening,前面的library--infection--drug
screening--genomic DNA extraction都懂。后面的deep sequencing部分就糊涂了。
理论上讲，resistant的细胞一定是有基因改变了的，我一直以为挑单克隆，一个一个
去作整个genome测序。仔细读了文章，是药物筛选几天后，细胞pool一起，再作deep
sequence；对照没有drug筛选（Non-resistant)的组，找出那些被CRISPR改变了的gene
，再确认。
几个问题：
1。这个deep sequencing是测（整个）genomic DNA，还是测留下来的guide sequence
（在lentiviral vector上面）？
2。可以测mRNA/cDNA序列来代替genomic DNA吗？突变的基因总该表现在mRNA上（先不
考虑其他类型的RNA）。
3。因为是pool一起的，不... 阅读全帖 |
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D***a
发帖数: 516 | 35 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
粒序列没问题。
为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。 |
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D***a
发帖数: 516 | 36 我用过别的lentiviral vector过表达GFP和其他蛋白，没有selection marker，但我能
得到细胞几乎100%阳性。我认为我做病毒的方法是没问题的。 |
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D***a
发帖数: 516 | 37 另外，我突发奇想，可不可以在hela细胞转染lentiviral载体和表达integrase的质粒
，是不是也能整合到基因组里面去？ |
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f******k
发帖数: 856 | 38 我有点疑惑，你说你拿到的是病毒，怎么还转染（transfection）？你是说转导（
transduction）吗？
你的细胞是不是感染效率不高呢？可以尝试spin infection外加用polybrene （4ug/ml
)。在我手里用spin infection和polybrene一起的话可以把在B细胞的感染效率提到90%
甚至95%以上。
不过我都是自己克隆sgRNA进lentiviral vector，然后转染293细胞做病毒。如果是
sigma做的病毒有问题，你没办法知道。 |
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发帖数: 1 | 39 当初从别的实验室弄来一个带GFP的lentiviral vector.刚开始的时候还想着这个载体
不错，到时可以通过看GFP来估量感染效率。
结果今天把cDNA终于克完之后，突然意识到一个问题。载体里的GFP序列也会链接到我
的LncRNA的序列后面，等于最后出来的transcript是：
5'LncRNA---GFP 3'
考！！！！
所以想请问各位大侠，有没有表达LncRNA的经验。
我现在有个想法，就是：
1. 首先确认GFP前面有没有IRES
2. 如果有，我可否在我的LncRNA后面加一段polyA,所以最后的序列就是：
5' LncRNA---polyA----IRES----GFP 3'
可行否？ |
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j******i
发帖数: 939 | 42 你这个滴度还是不高
不知道你感兴趣的是哪种细胞 下面这篇文章用的是intradermal injection
Intradermal Injection of Lentiviral Vectors Corrects Regenerated Human
Dystrophic Epidermolysis Bullosa Skin Tissue in Vivo |
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g*********3
发帖数: 177 | 43 不知道版上有没有人做过C26 conditioned medium 或者一般的conditioned medium，
主要是为了研究medium的细胞因子，生长因子。 比较了几个不同的protocol，有几个
不同点
1. RPMI Vs. DMEM, 有的protocol不推荐加抗生素，有的在收集CM前12小时换成no-
serum medium,有的一直在用regular full medium. 不知道血清里的生长因子细胞因子
会不会背景太强（用之前是heat inactivated过的）。
2. 如果为了鉴定一些特定因子x，我看有一些protocol用抗体在收集的培养基里加入x
的抗体。 和lab的人讨论过，他们说这种免疫中和的实验不是很好做。。。（也没说出
个所以然，只是说抗体的affinity可能很低balabala）。 然后有建议说用shRNA KO,
我试过c26 gfp 转染，感觉效率很低，当然lentiviral可能好很多。
第一回做这个protocol，希望有经验的大牛能够指点下。谢谢。 |
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j****i
发帖数: 6 | 44 如果那位学者可以提供下列生物试剂材料，请和我们联系
1）杂交瘤细胞
2）MAMMALIAN细胞表达质粒（可用于建立Stable cell lines)
3）Adenovirues OR Lentiviral constructs
4) Any other useful cell based assays
谢谢！
Andrew |
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j****i
发帖数: 6 | 45 如果那位可以提供下列生物试剂材料，请和我们联系
1）杂交瘤细胞
2）MAMMALIAN细胞表达质粒（可用于建立Stable cell lines)
3）Adenovirues OR Lentiviral constructs
4) Any other useful cell based assays
或任何您认为有商业开发价值的材料及建议。欢迎合作！
Andrew |
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