j****x
发帖数: 1704 | 1 Adenovirus以及基于Adenovirus的重组载体显然可以有效的感染分裂及非分裂细胞，这
也是AdV载体的一个显著优势之一。
AdV是一种相对安全的载体系统，主要原因有几个方面：
1. AdV本身是一种广泛存在的低致病性病毒，大部分人都有一定的免疫力。
2. 只感染，不整合，致癌性低。这点相比retro/lenti-viral vector自然安全性高一
些（当然，也因为不整合，不能长期稳定表达，这是相比lenti的一大劣势） 。
3. 作为疫苗和基因治疗载体已经在临床实验中广泛使用了很多年
而Lentiviral vector目前也已经发展到了第3代第4代了，实验室安全性也相当好，但
是由于基因治疗应用中必然存在的这样那样的风险，必须尽百分之一万的努力去消除哪
怕那百分之零点零一的可能性，而且之前也有多次失败的教训，所以lentivector乃至
基因治疗这个领域至今始终无法再更进一步。也许在未来载体系统的基因组定点整合能
够实现的话，整个领域能够有所突破，这个显然将会是革命性的。
anyway，实验室操作无论是retro/lenti还是AdV系统，都必须严格在BSL-2级别... 阅读全帖 |
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z****g
发帖数: 3340 | 2 想要一个表达vector pCDH-CMV-puro/copGFP能否分享一下，可站内交流。 |
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B******o
发帖数: 496 | 3 SBI的？
这玩意儿titer不错。不过装的东西不能太大，否则包装效率下降的很厉害。超过3K就
自求多福吧，呵呵 |
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m*****n
发帖数: 760 | 4 把gene of interest克隆到lentiviral vector的时候，
除了coding seq，还能把3'UTR也带上吗？ |
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z*******9
发帖数: 112 | 6 No one will know?? Please comment, Thx, |
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b**********8
发帖数: 349 | 7 Key words: Clontech, Doxycycline |
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w******n
发帖数: 767 | 8 clontech 有tet-on lentiviral system |
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H****s
发帖数: 301 | 9 对于puromycin抗性的克隆筛选来说，这种情况是非常普遍的。看看你的载体吧，如果
标靶基因和puromycin抗性是由不同的启动子驱动的，那么你运气不太好，需要多筛选
克隆。主要有两种解释：（1）lentiviral/retroviral载体介导的异源表达，很普遍的
一个现象是整合到基因组的序列被flanking genomic sequences灭活。具体怎么回事，
现在还不太好解释。（2）低表达或者是不表达的细胞outgrow表达标靶蛋白的细胞，所
以，几代以后，你基本上丧失标靶蛋白的表达。
有两个建议：
（1）。使用抗性基因和标靶基因被同一启动子驱动的载体。标靶基因和抗性基因中间
有IRES。这样，产生抗性的细胞系必然表达标靶蛋白。如果被flanking genomic
sequences灭活的话，细胞会死亡，因为抗性丢失。
（2）。如果筛选到合适的细胞系，在前面几代要多冻存细胞。这样在后面的实验中你
不会丢失辛辛苦苦得来的细胞系。 |
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j**W
发帖数: 89 | 10 还想要用lentiviral表达。是不是要求太多了？多谢！ |
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z*t
发帖数: 863 | 11 我只知道addgene有个lentiviral tet-on/off的可以这么干，但是没有gateway,不过你
不急的话可以自己把attL从donor vector上PCR下来然后装在这个leniviral载体上 |
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j**W
发帖数: 89 | 12 这个addgene的lentiviral tet-on/off可以同时放shRNA和cDNA?有link吗?attL同时要
放在两个地方，怎么弄呢？ |
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a***n
发帖数: 71 | 13 My research is lentiviral-based gene therapy analysis in a mouse model
of beta-thalassemia. I also made and analyzed induced pluripotent stem
(iPS) cells from our mouse model for some preliminary data for grant. I
felt I like the field of iPS and would like to further my experience in
this field. First-author paper in review and I will be graduating soon
for my Ph.D degree. I will be very grateful If you have any information
about this kind of lab that has postdoc position available. Thanks a
l... 阅读全帖 |
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j****i
发帖数: 6 | 14 如果那位学者可以提供下列生物试剂材料，请和我们联系
1）杂交瘤细胞
2）MAMMALIAN细胞表达质粒（可用于建立Stable cell lines)
3）Adenovirues OR Lentiviral constructs
4) Any other useful cell based assays
谢谢！
Andrew
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m*********7
发帖数: 5207 | 15 For question #3: the purpose of cloning shRNA into lentiviral vector is to
produce virus particles, and in principle, every single target cell can be
infected. If you use shRNA plasmid directly, you can hardly get 100%
transfection efficiency. |
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G**L
发帖数: 413 | 16 不知道发在这里是不是会当作广告删掉，但是我还真不知道该发在哪里。如果版主们觉
得不合适，就删掉吧。
我收到一个RNAi公司的联系，推销他们的产品，并且询问是否有人愿意做他们在美国的
销售代理。本人既没有RNAi的经验，现在认识的人中也没有作RNAi的。所以就把消息发
到这里，希望有兴趣的朋友能够觉得有用。下边是联系我的人发给我的信息：
I'm the Business Development Manager from GenePharma, a well formed bio-tech
company in Shanghai. Our company is specializing in offering RNAi related p
roducts and services. The company performed very well in the past few years
and occupied around 60% market of its kind in China. We are trying to open-
up the oversea market of ... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 4671 | 17 哪个公司的好用一些？
在看 Open Biosystems 的 TRIPZ lentiviral shRNAmir，以及 Sigma 的 pLKO-puro-IPTG-1xLacO 和 pLKO-puro-IPTG-3xLacO。看着都不错，就是不知道实际上是不是靠谱。
哪位大牛给推荐一下吧。。。 |
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e**r
发帖数: 1144 | 18 查了一下手头的transfer plasmid的map,似乎是没有
packaging plasmid没有图
如果加一个SV40 ori, 会不会能提高titer ?
应该有人试过吧? 谁看过相关的文献? |
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j****x
发帖数: 1704 | 19 新一代lentivector中很多都带这个SV40 ori，在293T细胞中支持episomal DNA
replication，理论上对提高病毒titer肯定有好处。retroviral vector中最早的报道
是可以提高病毒滴度up to 2 logs，lentivector上的数据我不是太清楚 |
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C***Y
发帖数: 61 | 21 I am trying to generate cell line with inducible knockdown. I used Tet-pLKO
-puro, in which a puromycin resistant gene is placed downstream of pGK-TetR-
IRES. The problem I am having now is that the expression level of puromycin
resistant gene was so low that all the cells were killed by puromycin. I
heard that the single vector Tet-induicible system selling by Clontech is
not very good either. Have anyone found any system satisfactory?
Thanks. |
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b**********8
发帖数: 349 | 22 Why did you say the single vector Tet-induicible system selling by Clontech
is not very good? In contrast, I read many papers in which the authors used
the syetem to devolope inducible kd stable cell line and conduct in vivo&
vitro study. Below are some of them,
1)THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 29, pp. 20383–20396,
July 18, 2008
2)J Clin Invest. 2010;120(12):4289–4302. doi:10.1172/JCI42015. |
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r***e
发帖数: 2539 | 24 这个牛啊，哈哈。
能贴个链接吗？没找到。
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而在moleculer therapy上的一篇文章表明，lentiviral vector本身就可 |
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B******o
发帖数: 496 | 26 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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L*****o
发帖数: 48 | 27 sorry to referring this topic to ask a shRNA related question. When doing
shRNA transfection (lentiviral vector), do you need to starve the cells
using conditional medium? |
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s******o
发帖数: 187 | 28 Thank you for the information.
I saw too that before posting my question here. I am kind of looking for a
lentiviral cloning vector that carries SV40 then I can package my own virus
particles |
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d*p
发帖数: 534 | 29 I ever made a mistake, pack retro vector with lenti system. It failed. So I'
ll say NO. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 如果是这样的话那可就太麻烦了。我可不想把我好不容易克隆到retro里面的东西
又倒腾克隆一次。。。
I' |
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r***e
发帖数: 2539 | 31 不行。
另外包装lenti也要注意，尽量用第三代的。
切记不能把不同generation的vector和pkg mix混用，
有的公司为了规避patent，还在出售第二代的vector，比如说Openbiosystem有名的pLK
O shRNA vector，和Thermo的部分产品。
以前有实验室出过事故，包装出不安全的病毒。 |
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i*****i
发帖数: 154 | 32 试过，效率确实很低。
为什么不在Addgene买一个包装的质粒pUMVC (Plasmid 8449),65刀就可以搞定了。如果
你参加今年的AACR的会的话儿，可以在Addgene拿一个免费的coupon，会赠送一个质粒。
或者买一个phenix cell，效率很高。 |
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i*****i
发帖数: 154 | 35 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
三代。
其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
最有效的系统。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 谢谢！
我从来没有用过lenti, 所以都不知道有这种差别。受教了。
另外，为什么retro vector 不能装进lenti 系统里面呢？难道他们的包装
信号差的很远么？
我一直误认为lenti就是多了一个强行进入细胞核的蛋白，这么看来还是有
别的差别？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 37 no, it seems u need to do a better homework:))...the packing systems for
lenti and retro are the same except lenti need one extra...the difference is
lenti vector has the bosai element which determine the nuclear import...
that's why lenti can infect both dividing and non-dividing cells...frankly,
I haven't seen any retro which doesn't infect non-dividing at all... |
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i*****i
发帖数: 154 | 38 第二点，在表达载体上，第二代表达载体采用野生型的 HIV的LTR，而第三代载体采用
了chimeric的LTR，所以你经常会看到第三代表达载体的LTR写成CMV/LTR或者RSV/LTR用
来表示这种杂合LTR结构。
无论是lenti还是retro，LTR都既是promoter又是enhancer，比较一下lenti和retro的
LTR差别还是非常大的。
其实我们试过，lenti的包装系统可以包装retro的，而retro的也能包装lenti的表达载
体，只是效率非常非常的低，没有实际的可操作的意义，还不如直接用pcDNA3.1感染呢。
lenti里的特殊结构
WPRE (Woodchuck
Posttranscriptional Regulatory Element) from the woodchuck hepatitis
virus, increases transgene expression.
cPPT (central Polypurine
Tract) from the HIV-1 integrase gene, increases the copy number o... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 还不把你楼上的叫inanxx 啥的招同济去
如其CNS 记录比你还多和还牛
要不你当二当家的 让她/他当大当家的得了
就像林冲刚上了梁山那会儿...
有这气魄吗?
is
, |
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m******n
发帖数: 121 | 40 问一下，可以用rt-pcr测ltr的方法检测lenti的滴度吗？另外这个方法怎么样呀？主要
是我有一个lenti没有gfp，然后p24的试剂盒么又太贵，所以在考虑用rt-pcr测滴度。
。。。。 |
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t***i
发帖数: 114 | 41 哪种Cre少点细胞毒性？我主要做in vitro的细胞培养。谢谢了！ |
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n********k
发帖数: 2818 | 42 it depends on the titre, infection efficiency, promoter and ur system etc..
generally speaking ad-cre can be more effective but with higher toxicity too
...I would go with lenti-cre if it is effective enough but for some stem
cells, it might not work well... |
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t***i
发帖数: 114 | 43 I see, got it. I'll try lenti-cre first. Thanks a lot!
too |
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r***e
发帖数: 2539 | 44 如果用一个promoter，可以用一个2A把两个基因连起来。
他那个情况是必须要两个不同的promoter。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 46 我回答他问题的第一部分，针对Tyler的那个载体。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 if by GFP not luciferase
you can try CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer element and chicken
beta-actin) promoter
paper link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22378886
Mice strain link:
//jaxmice.jax.org/strain/016532.html
Description
The CAGs-rtTA3 transgene has a CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer
element and chicken beta-actin) promoter driving widespread expression of
reverse tetracycline-controlled transactivator 3 (rtTA3). High rtTA3
expression is observed in most tissues examin... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 49 thank you so much. I will read it. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 De rein.
today just met that pdf file on my Mac downloads folder with largest
file size.... |
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