m******5
发帖数: 1383 | 1 300bp确实没什么好担心的，要是中了楼主买彩票吧 |
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D*a
发帖数: 6830 | 2 300bp没问题，但是设计个digetion site也不麻烦，还可以留着用，何乐而不为 |
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m******5
发帖数: 1383 | 4 刚造了个老鼠还要再买allelle配两个上去的苦命默默飘过……
你能下载到final version么？NIH manuscript 看得很难受
w****[email protected]
Thanks!!!!!!!!!!! |
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r*******y
发帖数: 48 | 7 1. floxed 300 bp should not present any problem for recombination;
2. introducing a disgestion site is a good and reasonable design for future
southern verification, if there is no endogenous restriction site(s)
available for southern strategy;
3. you should pay more attention to the design of the arm length. Based on
my experience, over 5000bp/arm is recommended; shorter than this will reduce
the specific recombination efficiency, although some reports also suggested
that a shorter arm also wor... 阅读全帖 |
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C***2
发帖数: 62 | 8 Thank you for your reply.
The locus i knockin Cre is expressed in ES with low level. PI want to make
sure whether the inserted Cre work functionally or not before blastocyst
injection.
I recalled that i ever electrotransfer pEGFPN3 to ES, indeed i observed
sporadic GFP. So, i decide to use CMV-Loxp-gfp-Loxp to confirm the
construction.
I feel shame on the third point, how can i make this type of mistakes.
body
Addgene
have
within
in |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 这个有一点复杂，分很多情况
1，这两种细胞不会mix成一个pool，在组织学上有distinct的location
1.1 已知其中一种细胞表达的exclusive的marker，这种marker又有Cre Knock-in 小鼠
avaialbe, 那么可以用genetic lineage tracing的方法，通过观察Cre-loxp reporter
表达，看reporter是否会在另一个组织里出现。（利用Cre-loxp irreversibly mark
cell的特性）
1.1 不知道exclusive的marker， 可以用retrospective clonal analysis, 具体见这
篇 http://circres.ahajournals.org/content/early/2012/08/01/CIRCRESAHA.112.271064.abstract 主要思路是随机标记，
看你所说的这两个组织是否会被同时标记。
2,这两种细胞mix成一个pool
这可能就case by case了，能说具体点么？ 不同情况应该有非常多方法的 |
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s****9
发帖数: 932 | 10 Just the mice directly from JAX or breeder from your own colony.
If direct from JAX, I would say it is the compensation issue.
Cre |
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f*********0
发帖数: 861 | 11 我以前做的Rosa26细胞也是这样.这个东西有自发的翻转或删除.而且表达率还不低,拿
第一代都那样.所以我对科学真得失去了兴致,某些新的发现,其实都是假阳性导致的,可
笑的是一班"科学巨头"发表后,徒子徒生们就不得不从各个方面进行cover. |
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m******5
发帖数: 1383 | 12 这个东西一直有改进，比如后来加入了insulator 来防止transcription read through
, 没你说的那么夸张。 |
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s****9
发帖数: 932 | 13 My two cents:
How protein can be expressed with a stop code, which cause a frame shift?
For my personal experience, I used Rosa-Stop-YFP mice from JAX and cannot
see any leakage in Cre negative mice in any lymphocyte populations.
It's a transgene and thus it is possible that the insert allele can move and
incorporate into other promote region. In that case, you just need to
refresh your line and get a new breeder from JAX.
stronger |
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m******5
发帖数: 1383 | 14 rosa 是在rosa位点的knock in
and |
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h********n
发帖数: 4079 | 15 I guess stronger promoter will tend to have higher chance of transcription
read through.
But I could be wrong. Correct me with ref. |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 看哪个line吧，leak严重么？有的leak对自己的课题也没什么影响，照实写就是了，也
不会因为这个课题就不能做了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 RE LZ
pls refer
PMID 21063464
Liu Y et al.
Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. (2010).
PLoS One. 25: e13533.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21063464
>There are at least two possible explanations for
>these discrepancies.
>One possibility is that after many generations
of backcrossing to the C57BL/6 background, the expression of the
randomly integrated RIP-CreER transgene is enhanced, thus
increasing the probability of its nuclear entry, even in tamoxifenuntreated
cel... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 pls try Multiplex PCR by A, B and C three primers set (below figure that
X, Y, Z as A, B, C primers)
PMID 19936220
Generation and characterization of mice carrying a conditional allele of the
Wwox tumor suppressor gene. (2009).
PLoS One. 4: e7775.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19936220
or refer
Biology版 - 有没有可能出现假KNOCKOUT的情况?
hashuoy
2010-09-09 13:52:31
来自: 192.168.
1从公司订制的KO老鼠,带CRE基因,大半年折腾下来去掉CRE并拿到大量杂合子,按照公司
给的DATA SHEET, GENOTYPING双引物鉴定老鼠各基因表型正常,符合孟德尔遗传,但在对
培养的野生型和纯合子MEF细胞鉴定时,我发现虽... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 19 那你就是看到loxp了，那怎么也变不成3里面那个只少了个loxp的啊。你用p3p4怎么也
出不来wt allele啊，什么叫“两个分得很开”？
你说看到exon1了是有多清楚？你原帖的意思是读不下去了，我理解是两个以上不同碱
基的峰，你是这个意思吗？那这里看到exon1又是什么意思?
你把产物多长该从哪里读多长实际看到什么多长画画吧，图上没有比例不知道怎么说 |
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q***7
发帖数: 144 | 20 看来你不但好多东西没有说，而且表达还真是有问题。你的中文真的很难理解，尤其是
上面的解释。还不如英文清楚，虽然英文也有很多错误。
你说RESULTING SEQUENCE包括。。。。（我们一般从测序引物的那边说起，你这却从离
引物最远的那边说起）说明序列都测过过那个LOXP区域了。但是你中文里又说P２之后
７０BP就停了。
你不是搞分子生物学出身的吧？用P２做引物测序后面都是DOWNSTREAM，应该说P２后７
０BP。这targeting vector也不是你构建的吧？知道为什么要扩那么长吗？你如果能回
答出这个问题 说明你还懂些分子生物学。
你这图比例严重失调，GFP６００BP左右，你EXON１５００BP左右，图中差别却是几倍
。还有，你P３应该在GFP后面离EXON１１００BP左右的地方，你却标到了GFP的中间。
好啦，现在回到你的问题。你不应该用P２来当测序引物，离你需要确定序列的地方太
近。
最早测序时，测序引物后面５０BP左右（甚至到１００BP以上）的序列是读不出来的。
所以那时的测序引物一般设计在需要确定序列的上游至少５０BP以上。大多数引物都
设计在要确定的序列上游１０... 阅读全帖 |
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b*****y
发帖数: 196 | 21 没有做过，有个简单的问题想请教一下，我在外显子两边设计插入loxp位点的时候最少
需要离外显子的GT-AG边界几个碱基？内含子比较小，只有几十个，我担心插入loxp的
时候会不会影响本身的剪接？请大牛指教，谢谢。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 22 稍微回答一下各位的问题。就象我讲的，公司做科研跟科研机构做科研不是一会事。从
很多回复来看，许多朋友可能知道ZFN/Talen/Crispr这些技术，也知道很多文章出来，
但实际上可能并不了解这些方法在基因敲进／条件性敲除方面的应用现状。
其实不管是ZFN, Talen还是Crispr，技术一出来大家就开始在想利用这些方法在没有ES
细胞的物种（比如大鼠）上做基因敲进和条件性基因敲除了，算算已经有至少5年了（
我记得2009年我去圣路易斯的Sigma公司的时候，他们就已经用ZFN做了很多敲除大鼠了
）。比如模式大鼠，为什么没有得到大范围的应用？ 实际上很多做神经研究的人都想
用基因敲进大鼠（比如加Reporter的），和条件性基因敲除大鼠。就是因为目前的所谓
ZFN／Talen/Crispr＋打靶载体注射受精卵的效率太低，没有哪家公司能够真正规模化
的提供稳定的技术服务。
我们用Jaenish文章里的方法也做不出来，但我听说他们有非常好的显微注射高手，所
以我们怀疑可能是我们公司的注射手艺还不够好。但不管好不好，总要把这个项目做起
来呀。所以我们一直在研发新方法。而这种方法我们觉得效率... 阅读全帖 |
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l**********k
发帖数: 189 | 23 这是一个非常急需的大鼠。我们已经开始在大鼠上做rosa-loxP-STOP-loxP-XFP, 目的
是为了检测cre expression 特异性的。
不知道在小鼠研究中，神经和心血管领域哪种cre鼠最常用，这样我们在做cre大鼠的时
候，也有一个参考。因为想先做客户范围比较广，在科研领域最常用的，就象免疫研究
里的CD4-Cre, CD19-Cre, FoxP3-Cre, CD11c-Cre等。
谢谢。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 24 老板打算合作去做一个brain specific的knockout，还要inducible， 对方说做Cre－
loxp, 然后用tamoxifen 去induce， 要求我们提供一个brain specific的gene 去放
Cre -ER
我查了几个常用的brain specific的promoter
BDNF，但是似乎不是brain specific， 因为retina， prostate，kidney 也表达
CaMKII BAC, 这个貌似用的人不多，但是好像有文献说适合brain specific的knockout
不是做这个的，对于KO的知识仅限于Cre LoxP了.
有没有好心人给点建议， 该用那个 gene来放Cre-ER?谢谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 25 做一个基因的knockout,加两端同源臂到loxp-ura3-loxp，转化，挑克隆，提DNA，用
PCR鉴定。问题是上游片段能扩增出来（一个引物在5' flank用于做construct之外,反
向引物在ura3之内），然后下游片段（一个引物在3' flank用于做construct之外,正向
引物在ura3之内）怎么都不work。试了好几个克隆，也换了primer.别的基因knockout
都没问题。按道理上游能扩出来，就表明基因被knockout了。想double check,结果下
游就死活不work.
请教大家可能的原因。多谢！ |
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x********e
发帖数: 35261 | 26 loxp STOP loxp gene应该是最保险的吧 |
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l****y
发帖数: 486 | 27 Not sure about your point here.
For example, if you are studying a kinase function in neurobiology. You
found total KO of your gene leads to embryonic lethal phenotype, and
conditional KO of your gene in neuron leads to very interesting phenotype.
Culturing of KO neuron in vitro also showed dramatic phenotype.
Interestingly, restoration of kinase dead (KD) mutant in KO neuron fully
rescued the phenotype (same as restoration of WT).
You wonder whether the neuronal phenotype you observed in vivo i... 阅读全帖 |
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j********o
发帖数: 1085 | 28 optogentics可以得奖，那cre loxP要不要也给个？大家都是技术运用嘛，而且都使用
广泛，optogentics 还要仰仗cre loxP呢。。。。 |
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j********o
发帖数: 1085 | 29 optogentics可以得奖，那cre loxP要不要也给个？大家都是技术运用嘛，而且都使用
广泛，optogentics 还要仰仗cre loxP呢。。。。 |
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s********9
发帖数: 132 | 30 Thanks for the reply.
But in pratice, if one has to do this. What I can think of are:
1) as you said, hoping the homologous recombination during meiosis.
2) get a B+/- allele in A+/- background? 50% chance it would be on the same
chromosome.
Just don't know what people actually do in reality.
BTW, one pertinent questtion, when one makes transgenic mouse, is it routine
to pinpoint the integration site? (People often cross a transgenic mouse
with a KO mouse or transgenic mouse)
Especially for Cre-... 阅读全帖 |
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s********9
发帖数: 132 | 31 I simply brought this up out of curiosity for discussion. I have NO hands-on
experience with mouse genetics whatsoever.
For double KO. the chance gene A and B on the same chromosome would be 1/20.
People have done so many double KO. I figure this could be a practical issue.
For crossing CRE-transgenic mouse with LoxP mouse to produce tissue-specific
KO.
The chance are also 1/20 the CRE-transgene and your LoxP-cassette being on
the same chromosome.
I don't think it's necessary impossible to achie... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 32 我们现在要做PD1基因CKO的小鼠模型，想请教一下几个问题：
1.如果用CRISPR插入LOXP位点的方法，是要插在整个基因编码区的两侧？还是选择少数
几个外显子让其移码突变？
2.在操作的时候如果同时注射两个sgRNA，会不会直接把中间的片段删除掉了而导致敲
入LOXP的效率比较低呢？
求教！ |
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发帖数: 1 | 33 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 从我拿到的单双replacement克隆的比例看，不如直接多筛克隆，就差一倍呢。倒是可
以在实验流程上多点手脚，提高机会--如果是细胞生长必需的基因，两个guide有必要
；puro筛选可以比我作的再很一点。另外，可以考虑genotyping的时候，不做单个克隆
，而是一次十个二十个的做，有阳性混在里面后，再把那一组拿出来，克隆，再
genotyping。
要是非必需基因，可以考虑HDR上加一个G418 筛选cassette，放在intron里面，用loxP
放两边，以后用cre切掉。就不知道剩余的一个loxP会不会对splicing有影响。
Knockout |
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m*********D
发帖数: 1727 | 35 对BP系统不熟悉。你上次说可以不留下任何痕迹，那肯定比Cre/LoxP好。LoxP我记得蛮
长的，就是在initron里，也担心影响splicing。
个人觉得没必要两个颜色的selection maker。这样导致在两个homologous arms之间的
insertion太大。看了他用PCR来确认正确克隆，实际上是两个HDR arm上一边一个PCR来
确认的。不知道是不是担心PCR有不确定性，还用了southern来证明integration site
。这个太麻烦。从他用一个颜色的selection marker（Fig2)来看，拿到double-
replacement的效率不错，40%。说明一个颜色就可以了。或者，我就干脆用一个G418。
我记得一个G418的表达cassette只有1。2Kb,在这个cassette两边加PB,PB外面是HDR的
arms,一边1kb。这样，要确认正确克隆的时候，用一对在HDR template外面的PCR
primers,就可以解决了。这个PCR产物是1+1。2+1=3。2kb，NEB的Q5 polymerase应该可
以了。 |
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J***b
发帖数: 76 | 36 A Postdoctoral Research Associate position is available immediately to study
synaptic transmission/plasticity and alcohol abuse at the Texas A&M Health
Science Center.
Research in the lab uses state-of-the-art technologies, including patch-
clamp recording from genetically identified neurons using transgenic animals
, optogenetics and pharmacogenetics, analysis of structural plasticity using
3-D reconstruction of single neurons in combination with behavioral
procedures. For more details, please ... 阅读全帖 |
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b**x
发帖数: 3451 | 37 你要放到活体里么？如果是的话，好像可以用loxp什么的。到时给药，激活一个酶，把
基因切出来。但是要控制每天一定量的，我就不知道怎么弄了。 |
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b**x
发帖数: 3451 | 38 切掉很容易啊，就在水里喂一种药，然后就能打开某个酶（跟目标基因一块弄进去），
然后这个酶把目标基因切掉。就是那个什么cre-loxp 啥的system。活体里比较常见的。 |
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s*******t
发帖数: 3895 | 39 您分析的很好，很多都是事实，但是问题在于，你说的“会计板块boring“这本身就是
个伪命题，那么你再怎么去证明分析，都是没有意义的。我不是为了辩论而辩论，我现
在把其他几个专业版面在前20的帖子名字复制过来，大家都可以看一下，这些版面和我
们会计版面有什么不同：
Business版面:
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求新东方GMAT书 (转载)
CFA 1对金融PhD 有多大用处？
大家的MBA都是学的什么方向？
Marketing 就业情况如何？
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请问30岁读MBA会不会太晚？
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真心请教，如何确定网上发布信息的首发时间
请教购买示波器的经验
网上发布的信息，如果被删除还能取回来么？
真心求教qual... 阅读全帖 |
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s*******t
发帖数: 3895 | 40 您分析的很好，很多都是事实，但是问题在于，你说的“会计板块boring“这本身就是
个伪命题，那么你再怎么去证明分析，都是没有意义的。我不是为了辩论而辩论，我现
在把其他几个专业版面在前20的帖子名字复制过来，大家都可以看一下，这些版面和我
们会计版面有什么不同：
Business版面:
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真心请教，如何确定网上发布信息的首发时间
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网上发布的信息，如果被删除还能取回来么？
真心求教qual... 阅读全帖 |
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c*t
发帖数: 1063 | 41 请教前辈：
用cre和loxp的老鼠得到最终的KO mice之后，是不是可以用产生的其他double
heterozygotes （A-cre;Bflox/+ X A-cre;Bflox/+)来交配产生KO mice？就不用
follow原来的breeding strategy了吧？ |
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j*****q
发帖数: 82 | 42 hi, henben,
yes, the less than 100bp contains a loxp site. acutally i am also aware of
two HR event in it. but i dnt have any marker to select the 100bp events.
but it is quite easy to distinguish the insertion.
does it mean the second HR to integrate the 100bp will be very low
efficiency?
does it mean the introduction of 100bp will be just by chance? |
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D***a
发帖数: 516 | 43 我是新手，实验室搞到几只老鼠，loxp/cre KO那种，是smooth muscle特异的，不知道
生出小老鼠能用什么方法检测？谢谢大家。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 44 我们用的是Cre male，因为有的cre female在生殖细胞里面有早期表达，后代就都成
total KO了。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 45 cre对老鼠有影响的是它插入的位点，如果恰好是关键基因，就造成老鼠mutation了，
或者正好插入你想引入的基因附近，那么你就基本上别想拿到你想要的老鼠了。 |
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s******e
发帖数: 370 | 48 看是什么promoter的cre
我碰上过一个EIIa－cre，发现用cre的公鼠经常出现partial KO，查了资料发现这个
promoter在oocyte里最活跃，受精后保持短暂活跃。于是换成cre的母鼠，效果就好多
了。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 49 没说反么? EIIa Cre 的母鼠才应该是total KO才对么？公的EIIa－cre后代是mosaic的
正在做这个。
ps 跟lz说，不光是EIIa Cre这种已知的造成后代mosaic的会这样，我现在用的一个
camk promoter 的公的，后代也时不时出来几只 total KO，所以一般新老鼠，你要把
脑心肝肾皮肤什么的都做一遍pcr，还有dynamic的KO时间，来确定它是不是specific
的，和KO时间是不是和你想要的一致。 |
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s******e
发帖数: 370 | 50 就是说cre由卵子提供要保险一点，因为受精的时候卵子里已经有active cre了，这样
进去的精子的chromosomes立刻可以被process。如果是在精子里的话，它还需要时间
transcribe
不过不管怎样F1出来以后还都得再筛一次，选完全的KO去establish line |
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