a*******g
发帖数: 33 | 1 辛辛苦苦弄了一年，打算在老鼠身上用lysM-Cre敲除一个floxed的基因，结果酶活
性没怎么变化，蛋白含量变化也不到50％，mRNA倒是减少了80－90％。我觉得是很失败
，没法继续干下去了。可是老板一直不接受失败。即便失败，也要我去探讨为什么失败。
博士刚开始，碰到这种事，大家说说该怎么办呢？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 2 do you have back-up projects?
Do not put all the eggs in one basket... |
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M*****n
发帖数: 16729 | 3 好好研究，phd 本来就是一个training过程
如果让你这么容易就做出来了，发个nature, science那不是要把大哥大姐大叔大婶都
羡慕坏了。 |
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b********i
发帖数: 73 | 4 Although I do not have hand-on experience, I did hear that LysM-cre system sometimes is not efficient
enough for gene deletion. I do not know the specific reason. Some PIs are working on the development of
more specific macrophage Cre system. Hopefully we can hear about that soon.
败。 |
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a*******g
发帖数: 33 | 5
sometimes is not efficient
are working on the development of
soon.
The problem is that the supervisor doesn't accept such results, with doubts
whether it is my techniqual problem. And there is no back up plan. |
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D*a
发帖数: 6830 | 6 为什么mRNA减少了但是蛋白不怎么减少？feedback？其他的transcription factor一看
没有protein就使劲工作？
50% 的蛋白含量可以提供“不怎么变化”的酶活？那为啥生物体要弄100% 的蛋白含量
出来？
我觉得很有意思啊。
你试试 challenge 一下你的老鼠吧。好多系统的功能都是没事儿的时候看上去差不多
，只有这个系统需要应对危机的时候就显出来不好用了。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 7 adaptation不正是生物体最重要的特征之一么。１００％的量一般是最佳量，而５０%
情况下，基本功能尚能维持。这就类似于你一般需要两碗米饭才能吃饱，但一碗对付
个短时间没有任何问题。 |
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k***u
发帖数: 176 | 8 两个floxed allel的话加上一个KO 试试
败。 |
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S******9
发帖数: 2837 | 9 you need use double LysCre flox.
one cre only delete 40%~60%, double 90~96% |
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D*a
发帖数: 6830 | 10 diet restriction可是延年益寿的方法呀,一碗对付一辈子也没问题呀 ^_^
所以我说要challenge一下看看老鼠怎么反应 |
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a*******g
发帖数: 33 | 11 有人会这样想，可是已经发表的论文都是这样的，仅用一个cre。在动物身上如果用两
个cre的话，那么lysozyme M没法表达，相当于把lysozyme也KO了。请问，你是否有更
多的论据呢？ |
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a*******g
发帖数: 33 | 12 是这样想过，可是加大酶反应底物的量20倍，还是找不到很大区别。即便是有50％的蛋
白减少，也没达到KO的目的。继续探究，对Ph.D刚开始的我来说，风险很大。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 13 什么叫“加大酶反应底物的量20倍”？
你不是做老鼠么
如果我是老板，辛辛苦苦弄出来的ko，我也不舍的就这样扔了呀
最近刚知道某人花了一个博士一个博后，想在C elegens上重复别人的result （当然是
怀着接着往下做的目的），一个strain没做出来。。。郁闷。。。再换一条。。。还是
没做出来。。。再换苍蝇吧。。。还是不行。。。看看control。。。怎么他们的
control好像就不对头。。。继续做。。。control就是不对头。。。好吧，找个别的实
验室重复下。。。就是没结果。。。
现在投了一篇nagative的文章去nature，现在under review呢 |
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G********e
发帖数: 528 | 15 这个是KO，不是KD，一个细胞没了就没了，哪来的low还feedback
我觉得技术问题可能性很大
KO系统首先看Genotype，有多少KO，如果80％以上KO，再看mRNA，如果mRNA也是80％，
再看蛋白和活性
如果诡异的事情发生，也就是说蛋白和活性没有怎么改变，那不是更好玩！
说明细胞之间在沟通，没了的细胞叫有的细胞多生产一点。
建议再玩玩吧，没那么容易到end。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 嗯，我就是这个意思
lz可以不要只做细胞内通路，看看这个基因在整只老鼠身上是干嘛的 |
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G********e
发帖数: 528 | 17 可以搞到f/-的话可能会好一点
如果搞不到就把adenocre注射到睾丸里，然后让老鼠交配？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 18 f/-是说flox/-? heterozygote？
其实我也不知道他的cre是怎么回事。。。
这个cre在老鼠里面不表达的么？表达的话不就是现成的conditional KO
anyway，既然有flox的老鼠，弄个+/- 还是挺容易的
有MeuCre40和EIIaCre，都可以造成杂合体胚胎，再交一代就是+/-了
不过现在conditional KO才是王道吧，+/-好像都没人玩了
好多cre也都商业化了吧 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 19 一种可能是部分细胞被ko了,部分细胞没被ko,而你检测mRNA/蛋白/活性的时候,样品包
括了ko和没ko的细胞.另外一种情况是所有细胞只被ko了一个allele,另一个allele是wt
,也导致这种结果.所以要么该cre活性不够强,要么该cre在这群细胞中不均一表达.一个方
法是你可以把你的Cre;gene f/f的小鼠与GFP flox小鼠杂交,看看GFP的表达情况,同时
把GFP阳性的细胞FACS sorting出来,再检测mRNA/蛋白/活性. |
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G********e
发帖数: 528 | 20 我不太懂
我们老师跟我说过
解决什么问题是关键，用什么工具是其次 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 21 flox跟+/-杂交就可以产生flox/-,这样cre只需要delete一个allele.另外野生型老鼠都不表达Cre的. |
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s*********s
发帖数: 110 | 22 我怎么觉得这个project还是挺有意思的
做好control,如果结果还是这样，说明有些interesting的regulation在那里
败。 |
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a*******g
发帖数: 33 | 23 有认识西北大学的这些人之一的吗？想请教一下他们，因为他们选择了新的策略，不知
以前是否遇到了和我一样的问题。
Qi-Quan Huang1, Harris Perlman1, Zan Huang2, Robert Birkett1, Lixin Kan3,
Hemant Agrawal1, Alexander Misharin1, Sandeep Gurbuxani4, John D. Crispino2,
and Richard M. Pope1
Divisions of 1 Rheumatology and 2 Hematology/Oncology, Department of
Medicine, and 3 Department of Neurology, Northwestern University Feinberg
School of Medicine, Chicago, IL; and 4 Department of Pathology, University
of Chicago, Chicago, IL |
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a*******g
发帖数: 33 | 24 有认识西北大学的这些人之一的吗？想请教一下他们，因为他们选择了新的策略，不知
以前是否遇到了和我一样的问题。
Qi-Quan Huang1, Harris Perlman1, Zan Huang2, Robert Birkett1, Lixin Kan3,
Hemant Agrawal1, Alexander Misharin1, Sandeep Gurbuxani4, John D. Crispino2,
and Richard M. Pope1
Divisions of 1 Rheumatology and 2 Hematology/Oncology, Department of
Medicine, and 3 Department of Neurology, Northwestern University Feinberg
School of Medicine, Chicago, IL; and 4 Department of Pathology, University
of Chicago, Chicago, IL |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 我什么时候说野生老鼠表达cre了。。。。。。
如果有+/-老鼠，两个一交不就是-/-
都不表达Cre的. |
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Z**********g
发帖数: 222 | 27 -/-是conventional ko, 而fl/fl和fl/-属于conditonal ko;fl/-的优势是减少cre的压
力,效率更高. |
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D*a
发帖数: 6830 | 28 我一开始以为你说heterozygote
这样倒是解决了效率问题了，就是如果用wt当control，还要扔一半的老鼠，也挺浪费
时间的 |
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m*p
发帖数: 226 | 29 同意楼上几位，在 heterozygous background, 引入cre， 这样，deletion
efficiency maybe higher. 也有可能，you have to introduce ROSA26YFP to
monitor that every Lsm-Cre cells has Cre activity. |
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s*******g
发帖数: 483 | 30 我觉你的名字倒是很有意思
不好意思离题了LoL |
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b*******l
发帖数: 217 | 31 这个酶是不是有别的isoforms? 有没有可能是compensatory response? |
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i*****n
发帖数: 53 | 34 你的CRE没有 表达不够广泛吧。不是在所有lineage细胞里面都表达。因此有些细胞里
切掉了，有些没有切掉吧，最后导致mosaic 表达。 做一下IHC， 或者IF，看一下就知
道了。 |
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A******d
发帖数: 571 | 35 应该是细胞compensatively upregulate at post-transcription level so that
protein is reduced less drastically
如果你用cre/-, try cre/cre to knock down more DNA
酶活性没有变化很奇怪，你是怎么测的？会不会有别的类似的酶被上调了？
败。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 36 我的理解是, 你的老鼠身上不是每个细胞都表达Cre, 一般来说cre induced tissue/
cell specific KO, 需要有个办法检测在某个器官里, 有多少细胞发生了KO.
顺便问问Dua, 有什么办法检测我上面的问题吗? (检测在某个器官里, 有多少细胞发生
了KO.)
谢谢
败。 |
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w******n
发帖数: 767 | 37 没做过KO，但做过transgene,估计是cre表达效率的原因，做IHC检测cre表达效率，原
位杂交靶基因.
败。 |
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c********o
发帖数: 135 | 38 这个Cre line我用过，也是类似的情况，表达基本没有改变。后来换了Vav1Cre就好了
。但也有人用这个LYMCre work的。这可能和你的target gene的蛋白稳定性有一定的关
系。或者这个Cre在发育中表达太晚，有很多细胞escape了。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 39 听老板说过一个很悲催的案例
千辛万苦做了一个flox的老鼠，测序什么的都没问题，跟cre交配，死活不KO，折腾了
好半天，终于发现loxP被甲基化了。。。。。。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 40 按说这个DNA methylation应该是可逆的吧，说不定再传几代，LoxP sites又给
复原了，呵呵 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 41 LoxP sites的methylation很可能是组织特异的吧,就是有些组织能被cre knockout掉,
而有些不能? |
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b****r
发帖数: 17995 | 42 反了吧，是cre被甲基化了吧
loxp那么小的东西，有CpG island吗，能被甲基化吗？就是有几个C被甲基化了也没啥
大不了的
吧，难道就不能被切出来了？
cre这种大片段带promoter的东西被silent我倒是一点都不奇怪，其实基因组里大部分
东西都是有
潜在被表达的能力的，只是大部分被somehow抑制了而已 |
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c****l
发帖数: 1086 | 43 real-time PCR, calculate the combined / uncombined loxP, then you get the
ratio. |
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b*******n
发帖数: 8420 | 44 癌症太复杂。这东西就像搞掉本拉登一样，花了大量的时间、金钱，历经几代PI，消耗
了无数PHD和post doc的青春，终于搞清本拉登基因的机制，结果发现本拉登基因对总
体病例的贡献只有百分之几，甚至是百分之零点几。
另外癌症的早期诊断也很困难。人又不是实验动物，既不能随意取样又不能控制他的生
活环境，某天胸疼头疼肚子疼了，总不能凭空说是得癌症了吧。。但是这可能就是早期
癌变的迹象。等到发现的时候，可能已经从benign tumor变成malignancy甚至已经
metastasis了。至于治疗就更困难了，和癌症相关的突变基本上都发生在很重要的信号
通路和转录因子上，如果不能特异性的target癌细胞，对健康细胞的毒害作用很大。要
target癌细胞又不容易，cancer stem cell喊了好几年了，连个统一的phenotypical的
定义都没有。等到metastasis了，人家癌细胞到处乱跑，想去哪里就去哪里，只要drug
没有deliver到那里，癌症就会复发。
最后，癌症领域研究了这么多年，投入了这么多钱，吸引了无数为名为利为科学为混口
饭吃的人去研究，本身癌细胞又很容易折... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 287 | 45 不好意思我的说法有点误导。我的 BAC 上面通过 Cre-LoxP 反应又连上去了一个单独
表达的 GFP 质粒。我要表达的基因用 BAC 上自带的 promoter 表达，GFP 用质粒上带
的 SV40 promoter 表达，两个不干扰，但是只要有 GFP 的细胞一定会有我的 BAC DNA
。如果你感兴趣的话可以看看这篇文章
Wade-Martins R, Smith ER, Tyminski E, Chiocca EA, Saeki Y (2001) An
infectious transfer and expression system for genomic DNA loci in human and
mouse cells. Nat Biotechnol 19:1067-1070.
Dr. Saeki 人很好，想用这个质粒的朋友可以直接和他联系。pEHHG 质粒拿回来之后只
需要用 NEB 买来的 Cre 做体外反应就可以连上 BAC。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 好久没看review了。为了防止那些外源基因胡乱表达，
以前有inducible的，或者是cre-loxp一类的（这个效率
多高啊？有100%吗？），现在有啥更好的方法啊？
多谢了 |
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s**********r
发帖数: 13 | 48 谢谢指点,偶尔得到基因型正确的小鼠(1%),WB验证却蛋白表达又没有变化.
loxp |
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y****u
发帖数: 74 | 49 各位老大，用loxP老鼠交配RosaCreERT2，然后分离细胞体外4-hydroxytamoxifen如何
？ |
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f*******a
发帖数: 671 | 50 哈哈,我也正打算做相似的试验,培养loxp元代细胞再转表达cre的lentivirus |
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