n********k
发帖数: 2818 | 1 never did cloning this way myself...but I advised my former roommate to
develop the tech and I remembered he inserted three LoxP sites into a 25kb
or so plasmid within literally 2-3 weeks...I could be wrong since I was not
the one doing it...but I thought the concept was simple: u have the homology
adapters flanking the sequence of interests...someone say 30 bp may be too
small and could get lost...never did myself, don't know(maybe I shouldn't
have commented so surely:)))...I could ask my form... 阅读全帖 |
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C*********m
发帖数: 213 | 2 做质粒转化，克隆，质粒比较大，而且带有Tn7, Cre/LoxP sequences. Protocol上建
议用top10,不知道用DH5alpha会不会有影响？多谢。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 3 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
BAC transgene to Mouse 啦?
then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
if yes plus next Long-range PCR does not work well.
return to start point then do below steps or similar steps:
Generation of knockin mice
Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
homology arms, respectively, for targeting constructs (Figur... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 4 新技术作为技术储备到花钱不多，但只要用起来，就收不住了，铺开来，有多少钱也能
花光。
另外，不是所有的技术都有必要实现。技术不成熟的时候，完全可以等待未来更成熟的
技术再大规模铺开应用。而现实是，往往一个新技术出来，大规模应用就开始了。比如
，做酵母的同学都知道yeast knockout collections （YKO)。当时做的时候，就没引
入loxP sites，就大规模做了。用YKO strains 做double KO 就不方便。现在用zinc
finger nuclease技术做knockout mice，其实也有很多问题，但也开始大规模铺开了。
希望Sigma没从NIH拿钱做这个。
发生这种有技术马上就大规模上马的原因，主要是个人和小集团利益。有新技术，就有
忽悠钱的机会。而且，大规模做，自己5年的funding就有保障了。而且肯定能产生结果
。至于有没有用，那也肯定有的，作为工具。
还有，对技术应用能解决多少问题，事先的评估是很不够的。基本就听申请人瞎吹。讲
个例子，无论是传统的SNP／haplotype mapping，还是新一些的arrays，还是最新的
Next... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 5 新技术作为技术储备到花钱不多，但只要用起来，就收不住了，铺开来，有多少钱也能
花光。
另外，不是所有的技术都有必要实现。技术不成熟的时候，完全可以等待未来更成熟的
技术再大规模铺开应用。而现实是，往往一个新技术出来，大规模应用就开始了。比如
，做酵母的同学都知道yeast knockout collections （YKO)。当时做的时候，就没引
入loxP sites，就大规模做了。用YKO strains 做double KO 就不方便。现在用zinc
finger nuclease技术做knockout mice，其实也有很多问题，但也开始大规模铺开了。
希望Sigma没从NIH拿钱做这个。
发生这种有技术马上就大规模上马的原因，主要是个人和小集团利益。有新技术，就有
忽悠钱的机会。而且，大规模做，自己5年的funding就有保障了。而且肯定能产生结果
。至于有没有用，那也肯定有的，作为工具。
还有，对技术应用能解决多少问题，事先的评估是很不够的。基本就听申请人瞎吹。讲
个例子，无论是传统的SNP／haplotype mapping，还是新一些的arrays，还是最新的
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y*********u
发帖数: 183 | 6 问问，这种transgenic mice常用组件质粒哪里有卖啊？
搜了半天搜出来一堆老鼠，没有质粒 |
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v*********d
发帖数: 382 | 7 jackson has iDTR mice available, for plasmid, you has to request from
Germany |
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y**********o
发帖数: 37 | 8 lz给出的数据太少
只提到KO老鼠的脂肪少（体重也轻？）
一般的老鼠模型都是敲掉个基因以后老鼠出现各种代谢障碍
各种fancy的实验搞了以后说明该基因对于正常代谢是必须的
lz的这个基因比较有意思，是loss of function有意义
不知道gain of fuction会不会引起肥胖表型
另外发相关文章的基本套路很简单
先上gene expression pattern
是cKO还是global的
如果是global的赶紧上cre-loxP老鼠
然后show一下energy balance的情况
无非就是吃的多不多，消耗的多不多
给出个代谢异常的原因（吃得多消耗正常or吃得正常消耗少....各种情况都有)
接着发现了某个具体的分子机制（信号通路的基本实验技术）
下面最好来个rescue的实验
最后最最好扯点临床的数据（病人的标本）来增加点故事性 |
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x******a
发帖数: 143 | 9 Anybody working with Drosophila FlyC31 has experience of dropping the RFP
flanked by loxP using Cre line?
I've done some crosses and have really weird problems.
Many Thanks in advance!!! |
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 De rien.
plus
Bouvier J and Cheng JG.
Recombineering-based procedure for creating Cre/loxP conditional knockouts
in the mouse. (2009)
Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23:Unit 23.13.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19170029 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 LZ can refer
Methods in Molecular Biology, vol. 158: Gene Knockout Protocols
Edited by: M. J. Tymms and I. Kola
//www.powells.com/biblio?isbn=9780896035720
full text free download link:
//nhjy.hzau.edu.cn/kech/zwswjs/kc/ziliao/Gene%20Knockout%20Protocols.pdf
PDF file its pp30-32 1.3.1 Cre-loxP Chapter
NB: never used as business benefit |
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m***i
发帖数: 4637 | 12 Floxed line
Wiki cre/loxP
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.5 |
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h**********r
发帖数: 671 | 13 两个包子求colony pcr的protocol, 用于酵母的。试了好几种方法，都不太好用。我用
于常规的筛选gene knockout和cre-loxp的去除marker.
多谢多谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 14 两个包子求colony pcr的protocol, 用于酵母的。试了好几种方法，都不太好用。我用
于常规的筛选gene knockout和cre-loxp的去除marker.
多谢多谢！ |
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b******k
发帖数: 2321 | 15 现在已经没必要再搞ZFN了 TALE的精度和效率都好得多
要KI的话没有直接的办法，至少目前没有。但是也有几个组报道可以先KI个段序列，
loxP/FRT/AttP这种 然后再插入就容易了 |
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b******k
发帖数: 2321 | 16 现在已经没必要再搞ZFN了 TALE的精度和效率都好得多
要KI的话没有直接的办法，至少目前没有。但是也有几个组报道可以先KI个段序列，
loxP/FRT/AttP这种 然后再插入就容易了 |
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d*******8
发帖数: 93 | 17 I am from Klaus Rajewsky's lab, I have never heard this before. |
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G*****m
发帖数: 198 | 18 in zebrafish, some cells will happen. lox-DsRed-lox-GFP will become lox-GFP.
don't know why. |
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b*****g
发帖数: 119 | 20 新人求教 我在做一个基因的oocyte specific KO 拿到正确genotype的老鼠后 去做
staining 那个蛋白居然还在... 请问会是些什么原因呢 我的mating scheme如下
Cre+ ; fl/+ male x fl/fl female 得到 Cre+ fl/fl female
现在想到的问题有一下几个 1.可能蛋白在Cre前就已经表达了
2. 同时excise 两个有loxP的allele是不是不够efficient阿? 由于我做的是oocyte 所
以尽量选择让公老鼠carry Cre, 因为是homozygous lethal 我不是不是需要一步一步
的去除基因呢
请问大家我该如何着手解决这个问题? 谢谢了! |
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j*********o
发帖数: 237 | 21 为什么没人提最简单的genomic DNA genotyping呢，至少PCR能看到loxp被切掉之后对
应大小的条带吧 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 Biology版 - 怎么检测Cre KO的效率/比例
htscorpion
2011-03-26 18:16:36
来自: 69.250.
1我有个Cre-induced tissue specific KO mouse model.
在mammary gland里, 有些细胞会表达Cre, 可能是epithelial cell. 有什么比较方便
的办法可以知道有多少细胞表达了Cre然后完成KO?
IHC for Cre and the KO gene?
or in situ hybridization for the KO gene?
谢谢.
－－－－－
chugol
2011-03-26 23:14:05
来自: 75.64.
9real-time PCR, calculate the combined / uncombined loxP, then you get the
ratio.
http://ipv6.weiming.info/zhuti/Biology/31495849/ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 23 永远用dnase处理一下
kit不贵的
还有一个小建议, 如果能直接染色或者wb就不要用realtime来验证了.
首先不是最终数据, 其次realtime不是决定性数据
如果要在mRNA水平检测ko, 最好的方法是在loxp两端远一点的地方设计引物PCR测序.
有时会碰到alternative splicing多切掉一个exon蛋白自动in frame的囧事... |
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j**W
发帖数: 89 | 24 用P１做测序引物，过了该是loxP的还是Wildtype序列。看到Exon1了。所以我觉得我实
际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。多希望自己interprete错了呀。
allele |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 我也觉得是这个原因，p2后面接着就是loxP，读不出来正常。
他这是用p2测序，测出来是wt序列不是很正常吗，
前面说用p1测序（用P1测序是把P1加到管子里，用P2测序是把P2加到管子里，这个怎么
还能说混了。。。），还测出来wt，我就纳了闷了。
如果说两头要分别测，那应该P3跨到GFP外面，上游的wt 序列那里，否则很难理解为神
马要扩4k的产物出来，测的连1k都不到。
还有一个疑问就是不是筛ES需要测序的吗（我没筛过，但是感觉上是应该测啊），就
算老鼠要再测序确认也应该是现成的protocol啊 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 GC contents of that P2 to AscI site if >65% DMSO 5% to buffer or try
Clontech GC rich kit
Cycle time 35 that is no problem
pls refer
GC-rich PCR concerns DNA templates with high GC content, which is defined as
the percentage of guanine-cytosine base pairs. When amplifying templates
with >60% GC content (i.e 5' ends of most mammalian cDNAs), the three
hydrogen bonds shared by GC pairs lead to enhanced thermostability, which is
problematic for un-optimized Taq polymerase systems.
http://www.clon... 阅读全帖 |
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H*******i
发帖数: 196 | 27 如果是你说的原因，再加个给ecoli的marker就行了。。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 This is a good idea, although the size will be bigger.
Two baozi for LS. |
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m******5
发帖数: 1383 | 29 thanks very very much !!! google了一天没google到 |
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r********e
发帖数: 84 | 30 个人认为应该问题不大（效率可能会低一些）。印象中Denis Duboule曾做过类似工作
？ |
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s******d
发帖数: 795 | 31 如果cre老鼠的background是B6， flox基因老鼠的background是129. Breeding后得到
的conditional knock out是混合的background。如果没有时间crossbacking得到纯的
B6 conditional knock out，怎样用一定数量的对照老鼠来覆盖genetic
heterogeneity，从而和conditional knock out进行phenotype的比较？不知道版上有
哪位同胞遇到过同样问题或是知道怎样解决这个问题？谢谢回复。 |
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l*******u
发帖数: 79 | 32 我是这么做的（被老板逼得这样），设三组control，cre,f/f,wt，全都是littermates
就行了。看你怎么设计的breeding能产出这几种litter mates. |
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y****i
发帖数: 2194 | 33 看你研究的是什么问题 如果是对background敏感的表型
最后会有非常大的variation 会把你搞的抓狂
也许需要一个非常大的n才能看到差异
我劝你还是早点开始back cross 不然最后你还是要返工 欲速则不达。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 34 Speed congenic breeding. 4代拿到纯系 |
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c****1
发帖数: 1095 | 35 用的是shRNA，设计了好几个。KD的效率至少有70%。
难道要弄loxP+CRE？ 或者null？ |
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i*********0
发帖数: 915 | 36 intron几十个碱基，可能少了一点，我一般都是至少在exon留下50bps的距离，再插入
loxp位点。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 37 自从ZFN（后来的TALEN, CRISPR)开始应用以来，大家一直在找一种好的办法做基因敲
进。以大鼠为例，如果没有一系列的CRE工具鼠，大家就不会去做条件性基因敲除。但
除了小片段（或ODN)以外，大片段的基因敲进一直没有成功的报道。
这几年我自己也一直在想如何能够在这方面做点事情。做公司跟做科研不一样。科研实
验室里对效率不是很关心。比如可以通过注射几百上千的受精卵，最后只要有成功的就
算成功，然后发文章。而做公司更关心的是技术的稳定性，也就是除了高效率，还要重
复性好。所以我们就组建了一个研发团队，专门做大鼠的基因敲进研究。
经过一年多的摸索，最后终于找到了一种通过受精卵注射做基因敲进的方法。这个方法
的原理是通过利用ZFN/TALEN/或CRISPR先在染色体上切一刀，然后让带有同源臂的打靶
载体在切割位点进行同源重组。我们先在细胞系上进行摸索，最后得到了一个很有效的
基因组编辑系统。然后我们就看这个系统是不是可以在大鼠上用。因为信心比较大，我
们就直接进行双基因敲进实验了。分别是在大鼠CD4基因后面加上DsRed，在FoxP3后面
加上 IRES-DTR-2A-EGFP-p... 阅读全帖 |
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a*****i
发帖数: 679 | 38 同意。
在心血管发育领域，已经有许多成熟可用的Cre和loxP小鼠。特别是做胚胎早期发育阶
段，小鼠个体小，繁殖快，每胎个体多的优势就体现出来了（很多情况下mutant
genotype的胚胎只占25%）。周围用大鼠做心血管方面研究的主要是做心脏电生理，或
者成年大鼠的心脏病治疗方法（结构缺陷或者心肌疾病），而且用的大多是野生型大鼠
，这种情况下不会需要大量的genetic modified大鼠，也不存在大量的cross breeding
要做。 |
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T****u
发帖数: 424 | 41 为什么-/- lethal不可能呢？
embrynonic lethal?
虽然是睾丸特异性表达，还有些基因在发育过程中会瞬时表达，发挥作用就silence掉
了。
你最终看到的是组织特异性表达。
还是try Loxp吧。
transgenic
pups |
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r******g
发帖数: 600 | 42 你cross het 和 het 时，把 male的精子pcr一下，看看是不是根本木有ko haplotype！
如果是睾丸特异的，分析一下减速分裂！ loxp是个好主意！ |
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B******w
发帖数: 1040 | 44 如果是knockin到基因组里面的呢，不是环状的 |
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B******w
发帖数: 1040 | 47 比如说loxp2272 序列： ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTA。。。。。
ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTA 会导致deletion
ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTA。。。。。。。TAACTTCGTATA-GgATACtT-
TATACGAAGTTAT会导致inversion
那TAACTTCGTATA-GgATACtT-TATACGAAGTTAT。。。。。。ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-
TATACGAAGTTA会同样导致inversion吗
不好意思，有点迷糊，问题可能太傻了 |
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r********n
发帖数: 164 | 49 我遇到过好多次很类似的情况，应该是construct某种原因不稳定或者有一定毒性。我
出现问题的construct里面共同点是有很多loxP site，还有很多别的重复的sequence。
Culture总是无法扩大。没有这些序列的载体就没什么问题。最后合并了多个小culture
来提高产量。另外我的经验是这些construct在耐受性好的细胞里稳定些，比如NEB的5-
alpha F'Iq或者Invitrogen的stbl cell。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 50 Is it expressing Cre? I sometimes get that too if it is a Cre expressor. |
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