S*******m
发帖数: 34 | 1 I found the following paragraph on this webpage. I agree with him.
http://www.molecularstation.com/forum/microbiology-forum/20624-pfu-
polymerase-mixed-taq-polymerase.html
Pfu polymerase mixed with Taq polymerase
That won't work. Pfu is a polymerase. It's not capable of
proofreading without polymerizing. So, it won't follow Taq around and
act as a high fidelity proofreader. If you mix the two enzymes, you'll
have some strands of DNA that are high fidelity (which were synthesized
by Pfu), and oth... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 都是理论家。
实际上，pfu+taq能比Taq大概准确6倍，显然不是一部分Taq合成，一部分pfu合成
就能解释的。你要能证明就算pfu一点错误也不出，也只有1/6的amplicon是Taq
合成的，实际上Taq用量要比pfu高。
我的解释是，polymerase在体外合成DNA是一个dynamic的过程，尤其是错配以后，
会导致Taq的移位不顺畅，造成减速/甚至掉落，然后高保真酶就会上去用3->5
exo活性把错配切掉，继续合成。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 3 建议
1.pfu掺三倍taq, 用taq批，pfu校对
2.注意hot start
3.换酶，phusion/hifi taq |
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n***w
发帖数: 2405 | 4 1。您的意思是比如说50ul体系用0.2ul pfu, 加0.6ul taq？太多了吧。。。
2。pfu应该要hot start吗？
谢谢。。。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 annealing太低，IDT算出来的都是不准的，建议用gradiant试一下52/55/57,
尤其多加Mg效果就类似降低annealing。另外用pfu你的延伸时间太短了。
建议用Taq+pfu, 注意hot start
94*2 － （94*0.5 -> 52/55/57*0.5 ->72*2) *35 cycle -4C |
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S*******m
发帖数: 34 | 6 这个'6倍'是否有据可查? 另外,不是说用3倍于pfu的Taq吗?
减速说明合成还在继续,高保真酶怎样修复? 把pfu拽下来自己上去?
这个'掉落'有多大可能是一个很关键的问题. |
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s******s
发帖数: 13035 | 7 6倍就是pfu的准确度，很多commercial的mix就这样称的，应该会有
实验证实，你可以自己去查。
Taq不是永动机，会fall off是常识，尤其是有mismatch，或者非正常
dNTPs. 在fall off的mismatch位置，pfu虽然浓度低，但是有相对优势。
Btw, Taq错配老是fall off也是不能用Taq批长片段的原因 |
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n***w
发帖数: 2405 | 8 用taq克隆了一段时间发现有突变，于是从stratagene买了pfu回来。。。
结果就杯具了。。。都摸了1周多条件了。。。
我要p的是cDNA，从公司买回来的vector。。。
primer1的Tm在55度，primer2的Tm在57度。。。于是我annealing temp用50度走。。。
看到instructions说amplify cDNA，要加Mg到3mM。。。
于是我就照做了，
那次很幸运，出现了条带，可是我再用同样的条件去重复，就是出不来条带。。。
唉。。。 |
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S*******m
发帖数: 34 | 9 同学,早该抛弃pfu了. 上NEB的Phusion吧.又快又好. |
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f*******e
发帖数: 354 | 10 pfu不是都有配好的2X buffer吗？ 主要是它的延申效率第一点 600b/min |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 0.1pfu+0.3taq，其实0.2+0.6也没关系，用pfu的buffer。
hotstart对所有难批的都至关重要。 |
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b******9
发帖数: 102 | 12 pfu的扩增效率的确有点低，最近扩出来的都是几百bp的小片段 |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 今天多加了点模版，然后用pfu和taq混合，3:1，pcr，条件没变，然后出了条带，然后
回收了。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 14 大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的 |
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n***w
发帖数: 2405 | 15 嗯，我今天把pfu和taq混一起跑了，跑出来了。然后切胶回收了。
谢谢。
的？ |
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S*******m
发帖数: 34 | 16 当心突变.理论上讲pfu不会correct Taq 产生的错误.记得测序完了上来汇报一下. |
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s**f
发帖数: 365 | 17 哈哈，我知道一个实验室也是。
而且我一直用的都是pfu，从来没有p不出来的。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 18 帖个纯化的protocol吧。
大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的 |
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S*******m
发帖数: 34 | 19 我知道会fall off. 关键还是概率有多大.如果不掉下来,pfu上不去,对不对?
如果Taq错配老是fall off,那只用Taq时不是就有一个筛选的作用,有突变得不到全长;
而得到的全长
没有突变. |
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n***w
发帖数: 2405 | 20 上次买的phusion来了，然后用pfu+taq弄出来的做模版用phusion做，相当impressive
！！！！
回收率也不错，明天直接把pcr产物送过去测序看有没有mutation。估计周五就知道结
果了，大家也就别争拉。
谢谢各位的帮助。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 21 pFU HF PCR product is blunt-end. What should I do for a TA cloning? Thanks. |
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h**********r
发帖数: 671 | 22 pfu的PCR产物回收后加普通taq,不加引物，加dATP,没有的话dNTP也可以。直接68或72
度干个20来分钟，回收连T载体。 |
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s**o
发帖数: 114 | 23 问一个关于HIV病毒的学术问题
公司让我评估一个新玩意，可惜我是门外汉，需要专家的指点。
这个新玩意是为防止不小心被艾滋病毒污染的针头感染的一个保护措施，号称能够将
HIV病毒瞬间（< 0.5 秒）从200 PFU/transmission （对比样）降低到< 5 PFU （新玩
意）。
我现在的问题是，艾滋病毒数量有没有一个感染的最低门槛值。虽然最后少于5个HIV病
毒穿过了，但只要有一个病毒，是不是同样会感染艾滋病。
查了很多资料，头都大了。隔行如隔山，恳求您的指点。大部分资料里面都是用的
viral load是copies/ml为单位，不是PFU/ml。这二者之间的区别何在，如何换算。
因为是外行，问错了问题的话，请不要见笑。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 24 ☆─────────────────────────────────────☆
moses (Moses) 于 (Thu Jan 25 15:04:29 2007) 提到:
4kb，clone用。大家都用什么酶？Pfu扩了几次没出来。
☆─────────────────────────────────────☆
anoia (阿诺) 于 (Thu Jan 25 15:11:36 2007) 提到:
pfu本身processivity应该不是问题，估计不是酶的问题
☆─────────────────────────────────────☆
steedwang (Postpone Fever) 于 (Thu Jan 25 15:20:40 2007) 提到:
4kb clone出来的点突变的可能性大吧，一般长的我都分段做。
☆─────────────────────────────────────☆
anoia (阿诺) 于 (Thu Jan 25 15:42:52 2007) 提到:
ft，Pfu的fidelity p个4k算个啥啊
如果 |
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s**o
发帖数: 114 | 25 公司让我评估一个新玩意，可惜我是门外汉，需要专家的指点。
这个新玩意是为防止不小心被艾滋病毒污染的针头感染的一个保护措施，号称能够将
HIV病毒瞬间（< 0.5 秒）从200 PFU/transmission （对比样）降低到< 5 PFU （新玩
意）。
我现在的问题是，艾滋病毒数量有没有一个感染的最低门槛值。虽然最后少于5个HIV病
毒穿过了，但只要有一个病毒，是不是同样会感染艾滋病。
查了很多资料，头都大了。隔行如隔山，恳求您的指点。大部分资料里面都是用的
viral load是copies/ml为单位，不是PFU/ml。这二者之间的区别何在，如何换算。
因为是外行，问错了问题的话，请不要见笑。 |
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s*****g
发帖数: 731 | 26 非常感谢各位回答。因为发完贴就回国了，然后签证悲剧的被check了很久，所以没法
上来看贴。
我之前的问题写的不太清楚。
我有一株疫苗，这株疫苗本身的PD50（半保护剂量）是10 PFU。所以1.0e+4 PFU的注射
量，能提供完全的保护作用，可以抗击1000 LD50的野毒challenge （通常challenge是
在接种疫苗后第28天进行）。
所以，committee想知道我们的疫苗为什么能起到保护作用。他们让我做adoptive
transfer。我就尝试了2次。按常规方法，给balb/c male老鼠通过鼻腔接种1.0e+4 PFU
疫苗，在第28天时取serum，把100ul serum在同一天通过眼底静脉打到naive mice里，
24小时后，通过鼻腔注射challenge 5*LD50 的野毒。
按照道理，应该能提供保护，但老鼠都死了。
我又按同样的做法做了一遍，但这次transfer的不是serum，而是2e+7 spleenocytes，
24小时后，仍旧通过鼻腔注射challenge 5*LD50 的野毒。同样的，老鼠全死了。
所以很奇怪一点，同样是在疫苗接... 阅读全帖 |
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s**o
发帖数: 114 | 27 公司让我评估一个新玩意，可惜我是门外汉，需要专家的指点。
这个新玩意是为防止不小心被艾滋病毒污染的针头感染的一个保护措施，号称能够将
HIV病毒瞬间（< 0.5 秒）从200 PFU/transmission （对比样）降低到< 5 PFU （新玩
意）。
我现在的问题是，艾滋病毒数量有没有一个感染的最低门槛值。虽然最后少于5个HIV病
毒穿过了，但只要有一个病毒，是不是同样会感染艾滋病。
查了很多资料，头都大了。隔行如隔山，恳求您的指点。大部分资料里面都是用的
viral load是copies/ml为单位，不是PFU/ml。这二者之间的区别何在，如何换算。
因为是外行，问错了问题的话，请不要见笑。 |
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h*h
发帖数: 27852 | 28 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 致爱国鸡血愤青：中国尚未掌控的核心技术清单，让你了解该抵制些什么！
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 29 12:46:32 2018, 美东)
日本就是牛逼，世界第一名副其实
致爱国鸡血愤青：中国尚未掌控的核心技术清单，让你了解该抵制些什么！
2018-03-26 不读平凡书
来源：知乎/ WPR
认清自己科技水平不妨碍我们爱党爱国爱人民。
1、A ：半导体加工设备
基本被日本，美国霸占，看Intel的最佳供应商就知道了。
目前蚀刻设备精度最高的是日立。Intel离不开其供应商，有些是独家供应，其他厂商
想买都买不成。比如东丽，帝人的炭纤维，超高精密仪器，数控机床，光栅刻画机（这
个最牛的也是日立，刻画精度达到10000g/mm ），光刻机（ASML）等等，这些是美日严
格限制出口的
一个块CPU要制造出来，需要N多设备和材料。全球前十大半导体设备生产商中，有美国
企业 4 家，日本企业 5 家。
B：半导体材料
生产半导体芯片需要 19... 阅读全帖 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 29 2018-03-31 中华外参 中华外参 微信号 zhwc826
功能介绍
《中华外参》解析中华未来，参考社会之道！
来源：天涯论坛
编者按：
在本次中美贸易战中，我们的民族情绪膨胀到爆棚。很多人认为，我们当前经济实力已
经足够强大，出口的都是工业品，可以完全摆脱贸易规则，和老美这个农业大国“”摊
牌大干一场了！但是，任何贸易的背后，都是实业在支撑！没有实业的强大，就没有贸
易的支撑。这篇文章，可能会让我们一些人更加清醒，我们到底有没有挑战世界老大的
实力？我们的制造业和世界一流水平到底还相差多远？
1、A：半导体加工设备
基本被日本，美国霸占，看Intel的最佳供应商就知道了。
目前蚀刻设备精度最高的是日立。Intel离不开其供应商，有些是独家供应，其他厂商
想买都买不成。比如东丽，帝人的炭纤维，超高精密仪器，数控机床，光栅刻画机（这
个最牛的也是日立，刻画精度达到10000g/mm ），光刻机（ASML）等等，这些是美日严
格限制出口的
一个块CPU要制造出来，需要N多设备和材料。全球前十大半导体设备生产商中，有美国
企业 4 家，日本企业 5 家。
B：半导体材料
生产半导体芯片... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 30 原标题:中国目前还未掌握的核心技术有哪些？发人深省！
作者：宋景
来源：知乎
1、A ：半导体加工设备
基本被日本，美国霸占，看intel的最佳供应商就知道了。不同的是中国想买有些国外
设备，别人不卖。
目前蚀刻设备精度最高的是日立。其实看看英特尔的最佳供应商就知道了，一块CPU要
制造出来需要N多东西。INTEL的牛逼，离不开其供应商，有些是独家供应。其他厂商想
买都买不成。比如东丽，帝人的炭纤维，超高精密仪器，数控机床，光栅刻画机（这个
最牛的也是日立，刻画精度达到10000g/mm ），光刻机（ASML）等等，这些是美日严格
限制出口的。。分不清啥叫蚀刻机，啥叫光刻机，啥叫光栅刻画机的自己去GOOGLE。
以下是英特尔颁布的 SCQI和PQS 奖最佳供应商：
1 、SCQI奖 （英特尔用的蚀刻设备和显微镜，监测装置就是日立的）。
2、 PQS奖
可以看到一个块CPU要制造出来，需要N多设备和材料。 前十大半导体设备生产商中，
有美国企业 4 家，日本企业 5 家。
B:半导体材料
生产半导体芯片需要 19 种必须的材料，缺一不可，且大多数材料具备极高的技术壁垒
，因此半导体材料... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 31 中国目前未掌握的核心技术有哪些？ 多项大幅落后美日
近些年，中国在科技领域的进步很快，也让无数中国人深感自豪。然而，大家是
否思考过一个问题：中国目前还未掌握的核心技术有哪些？在知乎，各个领域的“大神
”给出了一些答案，结果令人震惊。这些答案比较专业，估计会有很多人看不太懂。但
简单来说就是一句话：中国还未掌握的核心技术，还有很多，绝对超出你的想象。差距
很大，中国仍需加油！
这篇文章很长，只是覆盖了冰山一角。虽然有争议，但绝对值得一读。
以下只是冰山一角。总之，如果你深入了解，全世界任何高科技产品，都离不
开美日的材料，零件，设备，美国软件第一，日本硬件第一。别看媒体上扯淡的多，这
两个谁也离不开谁。
1、A 半导体加工设备
基本被日本，美国霸占，看intel的最佳供应商就知道了。不同的是中国想买有些
国外设备，别人不卖。
目前蚀刻设备精度最高的是日立。其实看看英特尔的最佳供应商就知道了，一块
CPU要制造出来需要N多东西。INTEL的牛逼，离不开其供应商，有些是独家供应。其他
厂商想买都买不成。比如东丽，帝人的炭纤维，超高精密仪器，数控机床，光栅刻画机
（这个... 阅读全帖 |
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b***i
发帖数: 3043 | 32 用了中文字体，不管用？
frame 窗口里面的控件比如文本编辑器可以显示中文。菜单却显示方块
Font pFU = new Font("Simsun", Font.PLAIN, 15);
addMenu(pFU);
public void addMenu(Font myF){
menuBar= new MenuBar();
menuBar.setFont(myF);
...
psizeMenu = new Menu("中文");
psizeMenu.setFont(myF);
addMenuBar(menuBar);
仍然不对，哪里的问题呢？ |
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R*s
发帖数: 2041 | 33 It's called QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.
Just seach stratagene website for it.
It's very easy to use. One thing is they usually give little
Pfu turbo compared to the other reagents from the kit. So you'd
better buy some extra Pfu turbo yourself if you are doing a lot of this. |
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R*s
发帖数: 2041 | 34 It's called QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.
Just seach stratagene website for it.
It's very easy to use. One thing is they usually give little
Pfu turbo compared to the other reagents from the kit. So you'd
better buy some extra Pfu turbo yourself if you are doing a lot of this. |
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b******n
发帖数: 4225 | 35 实验中碰到，觉得有点小好奇
引物对A，同样扩增条件下，PFU ultra可以扩出，Taq无法扩出，何解？
引物对B，同样扩展条件下，PFU ultra无法扩出，Taq可以扩出，又何解？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 如题
Phusion Hot Start II和Herculase II该选哪个？
还是PCR的问题
Pfu Ultra II、Taq一开始都扩不出来
后来发现是模板的序列跟我们手上的序列不一致
现在根据测序结果设计了引物
Pfu Ultra II只有非特异产物出来
目的片段不算多大，4kb不到
GC含量也没有特别高，60%而已
一般的优化都试过了
现在老板支持买别的酶试试
大家说选哪个？ |
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S******e
发帖数: 393 | 37 我是这样做的：从公司买的cDNA（这样可以保证质量），好像也不贵，
然后用pfu（pfu from invitrogen or NEB，记不清了，两家都用过），
扩了两个4kb,测序，然后拼接为8kb的片段。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 38 目前用的是这个条件，
Pfu PCR reaction (1 reaction):
Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
Template (50ng) 1.0 μl
Pfu Ultra 0.5 μl
dNTP (25 mM) 0.5 μl
Buffer 2.5 μl
MilliQ 19.5 μl
25.0 μl
Thermal cycling condition:
95ºC 2 min
95ºC 30 sec
55ºC 30 sec
72ºC 4 min
25 cycles
72ºC ... 阅读全帖 |
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i*******n
发帖数: 48 | 39 收细胞的时候cold block很好用，但进口的很贵
我们是找公司定做的，一个几百块。
Ultra Pfu,rTaq,Hotstart Pfu可以找到给大公司做OEM的小公司
我都是一次买几百毫升，可以用很久.基本上cloning,mutagensis都解决了。
当然了，如果你自己做纯化更便宜。
内切酶可以买Fermentas的，3000RMB买一套酶(单买的话要好几万吧)
FBS你可以找公司一次买一批，FBS每年都涨价。
Gool luck. |
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y****d
发帖数: 46 | 40 Taq酶的特征之一是会在PCR之后在3'端加上polyA尾，这方便了作TA克隆，但是我现在
的实验不希望有这个polyA尾，是否什么办法把它去掉，变成和pfu类似的平末端？谢谢！
补充：实验必须用Taq酶，不能换成pfu或Phusion之类的酶。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 pfu和phusion hifi都高保，但是pfu这玩意儿真是很难用啊 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 42 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
，transformation
但我接着这里也有俩问题：
1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
这如何解释呢
2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
long-range PCR到底发生了什么。。。 |
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d*****r
发帖数: 45 | 43 我们一直用 Stratagene's QuikChange "XL" Mutagenesis Kit 做single mutaion，
最近想试试看别的pfu，发现pfu啊，dNTP啊什么的都可以换掉
但是 stratagene kit里的 "quick solution"还是很有必要加的
说明书里没有写这个buffer成份是什么
google了一下有人猜就是pure DMSO，不知道真的假的
请问有人知道吗？谢谢！ |
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d*****u
发帖数: 17243 | 44 西安话这几十年变化太大了
比如“猪”，正宗西安话念pfu
“中国”就是pfeng guei
现在还有几个这么说的？
还有“水”念fei
现在只有郊区才这么说了
另外长安县把“跳”说成qiao
现在在市区这么说也会觉得很奇怪了 |
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R****s
发帖数: 635 | 45 西安话是关中方言的一种代表。
其实就算是关中话也有差别。
西边的眉县，凤翔，岐山，宝鸡地区，水念成shei，猪念成zhi。
东边就是渭南，大荔，华阴，潼关一带过去叫东府，就把水念成fei，把猪念成pfu。
东边再往北的郃阳，韩城，也就是"三十年河东，三十年河西"中的河西之地,
因为靠近黄河，两岸人之间交流，通婚，方言中已经带了一些山西口音。
但北方话无论怎么变，相互交流还是很方便的，陕西山西河南的方言都比较容易懂. |
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n*****8
发帖数: 19630 | 46 Last edited by the author on Jan 30, 2013 2:13:11 AM PST
Ping Fu says:
Lin, I welcome your constructive feedback, but it looks like you didn't even
read the book. I also welcome you to have a direct dialog with me.
Obviously that you care about truth and facts, I do too. So I welcome you to
email me at p*[email protected], and I'd be happy to talk to you and to
address many of your questions. It seems that you and I grew up in very
similar circumstances, and I believe that you have good intentions.... 阅读全帖 |
|
d*******g
发帖数: 8992 | 47 武汉病毒所是疫情源头?石正丽:阴谋论者不相信科学
2020-02-06 19:24:55 来源: 澎湃新闻
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（原标题：武汉病毒所是疫情源头？无事实依据，学者呼吁不要凭空假设）
中国唯一的P4生物安全实验室所在地中科院武汉病毒研究所，近日卷入了“新冠病毒源
头”风波。
该研究所的石正丽研究员率领的团队是蝙蝠病毒研究领域的权威，也是中国SARS（严重
急性呼吸道综合征）病毒的源头攻克团队。然而，随着疫情的进展，“实验室病毒泄漏
”、“人为制造新病毒”等流言开始笼罩在武汉病毒研究所及石正丽等人身上。
2月2日下午，石正丽在朋友圈回应：“2019新型冠状病毒是大自然给人类不文明生活习
惯的惩罚，我石正丽用我的生命担保，和实验室没有关系。”石正丽曾经的合作伙伴、
美国非营利组织生态健康联盟（EcoHealth Alliance）疾病生态学家Peter Daszak在接
受《科学》杂志（Science）采访时也表示，每当新疾病、新病毒出现时，都会产生诸
如实验室泄漏或者生物工程制造一类的“阴谋论”，“这令人... 阅读全帖 |
|
d*******g
发帖数: 8992 | 48 要是看不懂报道的内容，那还是别传播病毒是人工编辑并从实验室泄露的谣言啦。
当然，对于独轮运，造谣是天赋人权！
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https://news.163.com/20/0206/19/F4NOA6MQ0001899N.html
武汉病毒所是疫情源头?石正丽:阴谋论者不相信科学
2020-02-06 19:24:55 来源: 澎湃新闻
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（原标题：武汉病毒所是疫情源头？无事实依据，学者呼吁不要凭空假设）
中国唯一的P4生物安全实验室所在地中科院武汉病毒研究所，近日卷入了“新冠病毒源
头”风波。
该研究所的石正丽研究员率领的团队是蝙蝠病毒研究领域的权威，也是中国SARS（严重
急性呼吸道综合征）病毒的源头攻克团队。然而，随着疫情的进展，“实验室病毒泄漏
”、“人为制造新病毒”等流言开始笼罩在武汉病毒研究所及石正丽等人身上。
2月2日下午，石正丽在朋友圈回应：“2019新型冠状病毒是大自然给人类不文明生活习
惯的惩罚，我石正丽用我的生命担保，和实验室没有关系。”石正丽... 阅读全帖 |
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