z*****6
发帖数: 1486 | 1 exactly...specificty is the main concern... Charge is an important reason,
and besides, aptamer is too flexible, can frequently undergo structure
change in response to target or non-preferential target..there are several
papers talking about these issues.
Pegaptanib is a successful example of aptamer used as a drug...
I doubt the specificty of aptamer for a long time. However, in nature, the
special DNA structures, like ribosome RNA, hairpin structures, cloverleaf
structure...can act as specific... 阅读全帖 |
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x*****o
发帖数: 441 | 2 饶毅为什么不说2009年ribosome得也有该给得没给呢，怕得罪Steitz？
是生物化学和生物物理学的工作，有时也给分子生物学。
和水通道，2004年蛋白质降解，2006年基因转录的结构生物学研究，2008年绿色荧光蛋
白，2009年合成蛋白质的核糖体结构。
给，两种错误都犯过。
通道）、也无特殊性。
作。基因转录领域，有两项工作的重要性毫无疑问高于解出转录因子的X线晶体结构：
发现第一个转录因子（Mark Ptashne）、发现RNA多聚酶（Robert Roeder）。但诺贝尔
化学奖委员会过分强调结构而忽略了转录领域中更重要的生物学工作。
后一次。 |
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x*****o
发帖数: 441 | 3 饶毅为什么不说2009年ribosome得也有该给得没给呢，怕得罪Steitz？
是生物化学和生物物理学的工作，有时也给分子生物学。
和水通道，2004年蛋白质降解，2006年基因转录的结构生物学研究，2008年绿色荧光蛋
白，2009年合成蛋白质的核糖体结构。
给，两种错误都犯过。
通道）、也无特殊性。
作。基因转录领域，有两项工作的重要性毫无疑问高于解出转录因子的X线晶体结构：
发现第一个转录因子（Mark Ptashne）、发现RNA多聚酶（Robert Roeder）。但诺贝尔
化学奖委员会过分强调结构而忽略了转录领域中更重要的生物学工作。
后一次。 |
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x*****o
发帖数: 441 | 4 这个我也不明白,所以想乘机问问.
因为是提纯一个系列ribosomal protein, 有的可溶有的不溶. 不知道是不是图省事,都
是一个方法纯化,或者没有更好的纯化方法? 实验室传下来的protocol 就是这样的.因
为我是新来的,所以也不知道原委.
实验室的有人说是包含体提出来的比较纯.所以即使可溶,也加长express 的时间,push
protein to inclusion body. 这样做是不是不好呢? |
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e**s
发帖数: 513 | 5 目前的理论好像是说，duplication的动力之一就是防备拷贝的时候出错的。至于多拷
贝的，最有名的就是ribosomal RNA gene了，官方的解释是说，没有translation的第
二轮的amplification，所以学要很多拷贝。
（病毒之类），而重要的东西很少能看到拷贝？ |
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x*****o
发帖数: 441 | 6 你这个实验具体是想得出什么结论呢? 如果要求不高我们一般都不校正. 你是做single
molecule FRET 吗? 做这个的人从来不校正的说.
以前实验室做得bulk FRET的实验,就是简单的测Ratio A来校正,操作很简单.
Z.K. Majumdar, R.P. Hickerson, H.F. Noller and R.M. Clegg, Measurements of
Internal Distance Changes of the 30 S Ribosome Using FRET with Multiple
Donor–Acceptor Pairs: Quantitative Spetroscopic Methods, J. Mol. Biol (2005
) 351, 1123–1145. |
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x********u
发帖数: 430 | 7 I have to design a forward primer consisting of restriction sites (8 base),
operator region (35 base), ribosome biding site (6 base), spacer sequence (
about 20 base) and the priming sequence (21 base) of my target gene. The
total lenth would be 100 base for this forward primer and the reverse primer
is just 30 base. Does anyone know if this primer set would be okay for PCR
amplifying my target gene (around 720bp)?
Thanks a lot. |
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w******e
发帖数: 1187 | 8 mRNA/ribosome/phage/bateria/yeast/microbeads/micro droplet display的铜锈们
都去什么会啊？
只知道有抗体相关的会，那做peptide/alternative scaffold/enzyme evolution
的有啥类似的会否？gordon系列有这个topic否？
多谢！ |
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s******9
发帖数: 283 | 9 还有，象ribosome/mRNA display这些single-molecule based display和yeast/phage
display在传统的screening环节相比是劣势还是优势？ |
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l*********1
发帖数: 351 | 10 要做大蛋白就用mrna或者ribosome display.不需要优化phage或者yeast 表面的蛋白表
达.
缺点就是贵,很贵,二screening稍微麻烦点,时间稍长. |
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l*********1
发帖数: 351 | 11 国内有人开始用ribosome display了.华西医学院不是有个教授做抗体工程还不错的.
赚钱就靠这个方向了. |
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s******9
发帖数: 283 | 12 mRNA display很贵，ribosome display还好吧。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 13 how come? doesn't ribosome display need cell-free expression system too?
that's the most expensive part bah |
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c********b
发帖数: 363 | 14 I used Invitrogen GeneRACer kit，which suggested nested-pcr.
Invitrogen's oligo adapter is about 60 nt，first PCR used adapter 5‘-end ~
30 nt primer and gene specific（GS) primer. Then they use close to adapter 3
'-end nested primer and another nested GS primer.
After the nested PCR, I sometimes still see multiple bands. I have to gel-
purify the PCR products with correct size and sometimes to repeat 2nd PCR to
amplify it before cloning.
One suggestion is to purify mRNA for RACE, which gives you mu... 阅读全帖 |
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z*******2
发帖数: 658 | 15 有哪位老大用过toeprinting吗？
本人头一次实验，用的是promega的RRL外加primer extension kit，效果不佳，
方法是首先采用PROMEGA的protocol，assembly ribosome complex，30°C，要求是
10min，我怕出不来，加到30min，
RT是在上述实验的基础上，加入2×primer extension buffer（AMV BUFFER）和sodium
pyrophosphate，30°C 30min，我延长到1各半小时，结果是不加rrl，也就是对照倒
有full length 和几条杂带，加了RRL 和CYCLOHEXIMIDE却没有所要的带，只有引物和
杂带，劳驾哪位老大给指点一二。 |
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c********b
发帖数: 363 | 16 I knew shot utr, but how could it be possible without utr in eukaryotes? No
cap? Where is the ribosomal binding site? |
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c********b
发帖数: 363 | 17 I feel it is not easy to conclude with current knowledge.
I knew two reference:
1, Mature blood cell has a capacity for splicing, even without nucleus.
This is on a 2005 Science paper
2, Last year, people showed mature blood cell has some sort of circadian
rhythm, suggesting that circadian is not maintained at transcription level,
but post transcriptional level. Last year one Science paper.
So our current knowledge may not be enough to explain. |
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g***j
发帖数: 40861 | 18 s*****[email protected]
thanks
Gene. 2000 Jul 25;253(1):55-66.
Sequence diversity of intervening sequences (IVSs) in the 23S ribosomal RNA
in
Salmonella spp.
Pabbaraju K, Sanderson KE. |
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J***2
发帖数: 444 | 19 Scott Blanchard
WEILL CORNELL MEDICAL COLLEGE
Structures of the Bacterial Ribosome in Classical and Hybrid States of tRNA
Binding
Paul Driscoll
UNIVERSITY COLLEGE LONDON
Tracking death domain complex assembly with NMR
Qing Fan
COLUMBIA UNIVERSITY
Structural studies of human GABA(B) receptor
Evripidis Gavathiotis
ALBERT EINSTEIN COLLEGE OF MEDICINE
Tracing a Killer's Path: Structural insights into the Activation Pathway of
Pro-Apoptotic BAX
Wayne Hendrickson
COLUMBIA UNIVERSITY
Structural Analysi... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 有所谓的co-translational degradation pathway, 细胞如果看到不顺眼的
蛋白，就一边合成一边降解了。
在极端的例子里能看到ribosome弄出来的一条多肽直接连到proteasome上 ，
简直就是直接送焚化炉了。
ligase |
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r**a
发帖数: 121 | 21 需要一些translation的知识，哪位能下到下面的paper
Chapter 2 Cell Signaling in Protein Synthesis: Ribosome Biogenesis and
Translation Initiation and Elongation
麻烦发送给l***********[email protected]
谢谢啦。。。 |
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c********b
发帖数: 363 | 22 我的主要蛋白(transcription factor，ribosomal protein, actin, etc)低温诱导也
主要在inclusion body里面（60%）。我现在什么蛋白都用这个法子，懒得试条件.
不同蛋白最后得到的终浓度不一样，但是基本都在mg以上。我一般做100ml,换算一下最
高的actin在25mg/l |
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h**********r
发帖数: 671 | 23 难道是ACP？瞎猜的～～～～没有做过小蛋白的表达。不过看paper提到下面一些策略，希望有点帮助：
1. Introduce an Ala codon (GCU) the second position of the sequence
2. Increase the AT content of the 5’-end, particularly codons 4 and 5, by
silent mutagenesis. This reduces the potential for mRNA secondary structure,
which may inhibit ribosome binding/translation. The studies identified a
distinct nucleotide preference for this region (A > T > G > C).
3. If possible, the preferred stop sequence (TAAT).
改变第二位氨基酸为Ala见得比较多。做过统计，在e. coli里偏好ALa. |
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i*****i
发帖数: 154 | 24 老大要找的质粒应该是叫STEMCCA
Stem Cells. 2009 Mar;27(3):543-9.
Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell
cassette.
Sommer CA, Stadtfeld M, Murphy GJ, Hochedlinger K, Kotton DN, Mostoslavsky G.
Abstract
Induced pluripotent stem (iPS) cells can be generated using retroviral
vectors expressing Oct4, Klf4, Sox2, and cMyc. Most prior studies have
required multiple retroviral vectors for reprogramming, resulting in high
numbers of genomic integrations in iPS cells and limiting... 阅读全帖 |
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e**o
发帖数: 345 | 25 Translational regulation
看了一些mrna转运的reviews。怎么都没提ribosome。 |
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g******0
发帖数: 290 | 26 Pech Markus; Yamamoto Hiroshi; Karim Zhala; et al. Unusual Features of the
Unusual Ribosomal Elongation Factor EF4 (LepA).ISRAEL JOURNAL OF CHEMISTRY.
2010, 50(1): 117-125
我的邮箱 g*********[email protected]
多谢多谢! |
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M*******C
发帖数: 183 | 27 Internal ribosome entry site/IRES
在NCBI里没找到，google了一些站点也没有。谁有现成的序列给一个，有链接更好！
thx |
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 SNHG5 Prostate cancer ribosome biogenesis
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19239895
//atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_SNHG5.html
//www.ebi.ac.uk/gxa/gene/ENSG00000203875 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 31 你就差多玛三个字
的关联=XYZ below shown
Xuemei又不做抗性和kinase（XYZ) ，人家做小RNA的代谢
害得我还以为你是她的原同事呢
BTW
既然centuribob (Planta) 的大 是专搞RNA world的
是Yonath Ada 的lab出来的薄厚 /PI 你认识吗? i mean met him/her before whom was PD
from her:
//www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2009/
//www.weizmann.ac.il/sb/faculty_pages/Yonath/
Weizmann Institute of Science, Rehovot, IL,
The amazing ribosome
link:
//www.euchems-prague2012.cz/files/euchems-adv-210x279-05.pdf |
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l**********1
发帖数: 5204 | 32 要是这个会的话 就别去显摆了 manuscript accepted and published 前
//www.euchems-prague2012.cz/
不然会得罪某位炸药奖获得者的话 楼主的老板 即使没有著名 也会让楼主Move On 吧
4th EUROPEAN CHEMISTRY CONGRESS PRELIMINARY LIST OF PLENARY AND KEYNOTE
SPEAKERS
Plenary 45’ lectures
Michl Josef, US/CZ, Convener
Bonačić-Koutecky Vlasta, Humboldt Universität zu Berlin, GE,
Metal- -Cluster Enhanced Photochemistry and Photophysics
Ciechanover Aaron, Tumor and Vas- cular Biology Research Center, Haifa, IL,
Why our proteins have to die so w... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 33 IRES One mRNA, Two Ribosome entry, sure two seperate protein.
P2A, encode One protein first then self break into two protein. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
BAC transgene to Mouse 啦?
then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
if yes plus next Long-range PCR does not work well.
return to start point then do below steps or similar steps:
Generation of knockin mice
Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
homology arms, respectively, for targeting constructs (Figur... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 35 I guess you can get ribosome+mRNA and then oligo-(dT). |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 可以用 ribosomal protein L15 或者GAPDH
xdjm |
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c**i
发帖数: 265 | 37 HIV TAT protein 可以通过结合target mRNA的 5‘UTR来激活translation。
在TAT不在的情况下，tagerted mRNA5’UTR形成一个能量很低的发卡结构，ribosome
不能read through。
ref Mechanism of HIV-1 Tat RNA translation and its activation by the Tat
protein。
一个例子仅供参考。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 基本上算是定论了。
目前的大部分基因分析结果都支持这个说法
因为线粒体内部的ribosome RNA 还有 codon usage都接近古细菌，而和宿主的不一样。 |
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F*K
发帖数: 608 | 39 IP用的是agarose beads, 质谱打出来有很多hnrnp和ribosome protein，这个是常见的
污染，但也看到好几个tRNA synthetase，而且peptide＃都挺高。
后悔没有做一个control IP。请问一下tRNA synthetase是经常看到的污染吗，多谢！ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 我也看到了好多ribosome protein，为什么呢？ |
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b******y
发帖数: 627 | 41 If you have a 50 a.a peptide with no particular 2nd structure, I call it a
peptide. Some polypeptides, like ww domains, have only about 40 a.a. (3
short beta strands packed in an antiparallel fashion), which can bind
proline-rich peptide ligands. I can call them proteins or at least protein
domains. I believe there are a few domains that are of comparable size or
even smaller than ww domains. Don't remember what they are called on top of
my head.
As we all know, it is so trivial to translate DNA... 阅读全帖 |
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s******9
发帖数: 283 | 42 E. coli ToA domain II, a very long alpha-helical domain and you can excise
any length of fragments from it for your purpose. It serves as a spacer
region for ribosome display. |
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c********r
发帖数: 1125 | 43 现在举这种例子不好。。因为很多情况3－4年不出东西你得career就完蛋了。。。
原来的例子很多。
比如结构里面 Max Preutz搞血红蛋白结构搞了将近20年。
ribosome的精细结构／rna polymerase的精细结构也搞了差不多10年以上。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 这个不一定需要是readthrough 啊，既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了 |
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c**i
发帖数: 265 | 45 这么说，ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么？这样即使第一
个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的，ORF2是luciferase，
untranfected的RLU是～500，有质粒的大约是1000倍，～300，000。 感觉信号很强。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 Biochem的senior 同学 Arieh Warshel 增强了计算蛋白folding背景的工作 拿了炸药
化学奖喽
The Nobel Prize in Chemistry 2013
The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize
in Chemistry for 2013 to
Martin Karplus
Université de Strasbourg, France and Harvard University, Cambridge, MA, USA
Michael Levitt
Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA
Arieh Warshel
University of Southern California, Los Angeles, CA, USA
“for the development of multiscale models for complex chemical systems... 阅读全帖 |
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s******9
发帖数: 283 | 47 其实楼主的问题我以前问过，当时没有什么讨论。再跟进一点想法：
高通量蛋白分析可以分in vivo（proteins in natural environment）和in vitro方法
。in vitro主要是protein array和Y2H，in vivo当然是MS。不用多说，各有明显优缺
点。
NGS的优点在于它是separation independent & single-molecule based。其他的
single-molecule技术都不能做high-throughput，原因是受限于limited fluorophores
。同理，蛋白分析能够也做到SM sensitivity和separation independent，将是true
breakthrough。
MS的优势很明显，但是sensitivity， throughput和cost-effectiveness都有瓶颈的。
所以in vivo基本无法做到single-molecule proteomics。但是对于in vitro，如果
protein被DNA barcoded（比如ribosome di... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 microfluidic platforms plus nanopore
pls refer
1)
Choi JW et al. (2012)
High-Throughput Analysis of Protein–Protein Interactions in Picoliter-
Volume Droplets Using Fluorescence Polarization
Anal. Chem. 84: 3849–3854
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac300414g
2)
Rudenko MI et al. (2011)
Controlled gating and electrical detection of single 50S ribosomal subunits
through a solid-state nanopore in a microfluidic chip.
Biosens Bioelectron. 29: 34-9.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21855314
3)
... 阅读全帖 |
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w*e
发帖数: 740 | 49 顺便问一个，
但是2A的原理是"ribosome skip",所以在前后两个蛋白的尾巴处都多留了一个或者几个
氨基酸，难道没人怀疑过会这个也许会影响蛋白的功能？ |
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w*e
发帖数: 740 | 50 确切地讲，不是切割
是翻译的时候直接ribosome skipping |
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