S*****s
发帖数: 287 | 1 我也觉得这个发现纯粹就是哗众取宠。DNA 编码了细胞的整个基因组不假，但是对于整
个细胞的生物功能来说蛋白质和 RNA (rRNA, tRNA etc) 的贡献更大。合成的 DNA 在
酵母菌内利用了酵母菌本身的蛋白和 RNA 才体现了它编码的基因组的功能，但是在报
道的时候片面的突出了合成 DNA 的贡献，结论太偏颇了。发表在 Nucleic Acid
Research 上面的文章反倒上了 ABC CNN 这些新闻，满让我困惑。美国不明真相的群众
太多了。
你提到的合成蛋白，我觉得国内 65 年合成的有生物活性的牛胰岛素比这篇文章更有学
术价值。主要牛在人工合成的蛋白能够折叠成天然蛋白的构型，还能有天然蛋白的活性
。只是牛胰岛素只有 51 个氨基酸，要是什么时候能合成一个大一点的蛋白，比如
ATPase 100kDa，而且在体外能折叠成具有生物活性的蛋白，那绝对是个重大突破。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 这个要测rRNA才能知道质量。你看一下自己的facility有没有
bioanalyzer，拿过去也就几块钱一个sample, 直接出结果，
不用跑胶然后分析 |
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g***j
发帖数: 40861 | 3 silva给好像是RNA序列，有DNA序列的么？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 agilent的bioanalyzer现在用的很多
的确又快用量又少
但是说白了其实也就是毛细管胶
一样是跑胶
一样是看rRNA的比例
没有这个条件的其实跑个琼脂糖电泳
照个照片
然后选择显示migrate/intensity
出来的图是一样一样的
只是没有人那样计算“RIN”而已
degradation |
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o**i
发帖数: 1165 | 7 h会不会rRNA位置那个是真的 splice variant?
crosshyb
neuron
crosshyb |
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f*****y
发帖数: 464 | 8 我暂时也不能确定。预测的mRNA大小在两条rRNA之间。可是每次这两条都同时出现，所
以就认为是crosshyb了。是不是如果拿sense probe做一下，如果这两条还出来就可以
肯定是crosshyb了？ |
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y******8
发帖数: 1764 | 9 rRNA could be inaccessible in ribosomes. Just as mentioned by BM, you should
be confident on your results with appropriate controls. |
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n****n
发帖数: 434 | 10 Why polyA RNA也有rRNA的位置crosshyb? |
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E****A
发帖数: 184 | 11 到目前为止还没有任何一个mRNA purification的kit能完全彻底除掉rRNA，总会有残余 |
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E****A
发帖数: 184 | 12 长是够长。不过根据我个人经验，强烈不建议用utr region来做probe，尤其是5’-UTR
。我曾经在5'UTR region做过两个probe，效果都很不好，全杂到rrna上了，结果后来
在中间部分的两个exon上做了两个probe，结果就很漂亮。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 提total RNA然后跑胶
发现预期的rRNA的条带全都比预期的要小
可是如果把marker那条lane去掉然后和别人paper上发表的图pattern基本是一模一样的
我觉得不是降解了
因为根本没有smear
而且降解不可能每条条带都变小一点然后整个pattern还是一样的
想问问看有没有人遇到过这种情况啊？
百思不得其解
而且我的marker跟DNA样一起跑的时候没有出过问题
size都是符合预期的 |
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m*********7
发帖数: 606 | 14 16s rRNA我不太了解。你做PCR的目的是什么？做探针？还是别的？预计产物希望是单
一产物？那既然这样的话，为什么不直接根据template设计好引物，查一下上下游引物
的结果的交集是不是主要是你的目标就行了？或者干脆做了去测序，是不是你要的东西
不就一目了然了？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 Yes, because those rRNA would not form dimer with each other |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 really?
no need to get rid of rRNA, do u care about ncRNA? Or the facility you
use will do all this for you? Could you please elaborate on your
experience? how about the pricing then?
thanks |
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c*********r
发帖数: 1312 | 17 我做了四个RNA-seq样品，前两个是mRNA-seq，后两个是自己用invitrogen的Ribo-
Minus除去rRNA，期望能得到long ncRNA。样品是学校的Genomic core facility制备的
，一个大概$400多，测序和分析是在collaborator那里做的，目前没要钱，所以还不知
道他家的价钱。
但学校Genomic core facility的报价是：2x75 GA v5 kits：$2060/lane.
去年七月份在new mexico的一个institute做了一个咨询，价格大概是这样的：
Given:
- 2 libraries (you have already used the illumina SIPE kit to make paired
end library)
- Request for mRNA sequencing (PE)
- Sea urchin. genome size is ~850Mbases http://www.scienceonline.org/cgi/content/full/314/5801/941 so... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 所以大家就看出了你不是学生物的。呵呵。磷作为能量分子什么的，可以省，
但是作为DNA, RNA这些分子的基本骨架，是没有办法省的。
生物在每繁殖一次，就必须复制一次DNA,而且做出一堆RNA, 所以这个磷肯定要
每次都用的。不是你想省就能省的。
所以他们的解释是砷代替了磷，这个解释还是合理的。
另外，大部分生物里面的磷元素的含量是有一个底线的。因为DNA必须有一定长度
才能编出足够数量的蛋白。而每个蛋白本身都必须有一个mRNA和它对应，再加上
所有必须的tRNA, 和ribosome里面的一大堆rRNA, 这个磷的含量可不低！
mass？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 19 1. 好氧细菌（16S rRNA鉴定）；
2. 不是严格的嗜砷生物（not obligate arsenophile）；
3. 此菌在磷存在的条件下生长得更好；
4. 在As+/P-的条件下，细胞中还是含有一定量的磷（从试剂中带入），但砷大概是磷
的7.3倍（文章中显示砷的测定不是很准确），而且此数量的磷据推测不足以满足细菌
生长的需要；
5. As+/P-条件下生长的细胞比As-/P+条件下生长的细胞大，主要是由于产生了PHB；
6. 作者通过实验证明As分布在细胞的各个部分，包括DNA, RNA, protein, lipids和
metobalites（放射性深和磷的分布）;
7. 作者讨论提到尽管含As的代谢物尽管相对于P而言很不稳定，但他们推测此菌有一套
应对的方法，比如说利用PHB的疏水环境。 |
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d********r
发帖数: 3279 | 20 Arsenic-associated bacteria (NASA's claims)
ResearchBlogging.org
Wolfe-Simon F, Blum JS, Kulp TR, Gordon GW, Hoeft SE, Pett-Ridge J, Stolz JF
, Webb SM, Weber PK, Davies PC, Anbar AD, & Oremland RS (2010). A Bacterium
That Can Grow by Using Arsenic Instead of Phosphorus. Science (New York, N.Y
.) PMID: 21127214
Note to new readers: I wrote this post on Saturday Dec. 4, mainly to
clarify my own thinking. I didn't expect anyone other than a few
researchers to ever read it. Since then I've made ... 阅读全帖 |
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m*****n
发帖数: 760 | 21 最近在做一些miRNA qPCR，mouse brain sample，
用的是Exiqon的universal miRNA PCR，
reference ctrl试过5s rRNA和U6，可是这2个ctrl好像不是很consistent，
所以不知道如何去normalize data。
请问版上大牛，你们在做miRNA qPCR时，用什么reference ctrl？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 跟物种有关啊
另外有的物种可以看到三条rRNA的带
所以不好说 |
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C*********u
发帖数: 811 | 23 的确
有时候我跑mouse liver RNA可以看到5s 那条band的
跟物种有关啊
另外有的物种可以看到三条rRNA的带
所以不好说 |
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j********r
发帖数: 156 | 24 You might need a pump and a UV read to harvest the fractions. If you take
the fractions manually, you can determine the RNA concentration on a
spectrometer. The polysome-rich fractions will be rich of ribosome and thus
rRNA. Good luck, |
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n*****e
发帖数: 119 | 25 可以用kit把大部分rRNA去除。看看能不能增强信号。 |
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c******y
发帖数: 148 | 26 模板是cDNA，
1，cDNA合成之前是否用Dnase I 消化
2，RNA降解途径或者RNA processing过程中会出现polyA加尾现象，我了解的至少植物
叶绿体的RNA的存在这种现象，刚google下，似乎哺乳动物也存在这种异常的加尾，用
oligodT反转录有可能会产生rRNA的cDNA
3 质粒做模板
miniprep的时候是否有痕量的大肠杆菌的基因组污染？
建议放弃PCR做模板，
酶切质粒，或者合成oligo探针
1，2，3的解释也仅仅是个人猜测了 |
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g***j
发帖数: 40861 | 27 哪段算哪个Helix啊
说是在 Harry F. Noller 1984年的文章stricture of ribosomal rna 里
我在在这文章里没找到呢 |
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w*****n
发帖数: 107 | 28 you can use RNA as a control, such as 47S rRNA or pre-mRNAs.
It is not control for loading, but control for the purity of fractionation.
If your cytoplasmic fraction is not contaminated by nuclear fraction, most,
if not all, of these RNAs should be in the nuclear fraction. |
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b*******e
发帖数: 288 | 29 98.6%的这个不知道，sequence similarity matrix的这个也不知道，不过
phylogenetic tree这里：
1、你用的什么序列？做进化树很灵活的，比方说很多用核糖体小亚基的rDNA序列，
有的人只用里面的conserved的部分来做，有的人则比的是SSU rRNA的二级结构
2、你进化树怎么做的，如果你序列比对的不好，也影响最后的结果，你可以自己再手
动调整调整那个比对的结果
3、用不同的方法做进化树，同样的dataset得出来的树也不一样，因为各个方法的算法
不同。你可以试一下MP，Bayesian和ML. 其中MP最简单，计算量最小。ML计算量很大。你的数据要很大的话，估计ML
太麻烦。
90% |
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g*********d
发帖数: 233 | 30 夏荣辉，李江
上海交通大学医学院，上海（200011）
E-mail：e******[email protected]
摘 要：基因的表观遗传学修饰正越来越受到人们的重视，它包括DNA甲基化和组蛋白修
饰，组蛋白修
饰又包括组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化。基因的表观遗传学改变在基因转录调节方面有
重要作用。最
近研究较多的是多种组蛋白修饰方式和DNA甲基化在基因转录调节方面的共同作用，本
文详述组蛋白
修饰和DNA甲基化的发生机制，并且总结了组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化与DNA甲基化之
间的相互作
用，提示不同位点的组蛋白甲基化与DNA甲基化共同作用于基因转录，并且发挥不同的
作用，具体体
现在组蛋白乙酰化、组蛋白H3K9、H3K27和H4K20甲基化与DNA甲基化协同作用，使基因
发生转录抑
制，而组蛋白H3K4甲基化与基因转录激活有关。
关键词：组蛋白修饰；DNA甲基化；关系
1. 引 言
目前，在研究肿瘤发生发展的过程中，基因的表观遗传学修饰所起的作用日益得到人们
的重视。组蛋
白修饰和DNA甲基化是两种最重要的表观遗传学修饰方式。研究表明，人类几乎所有类
型的肿瘤都存
在组蛋白及DNA甲基化的异常... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 “curve就已经向右shift得很厉害了（平台期基本上都还没达到）”
什么意思？
你上个图吧
如果是该是平台期的部分不是平的，而是有下降的趋势
那跟你第一步substraction有关
一般软件默认是把前几个cycle（比如2-5，2-8）的值取平均
（第一个cycle一般信号会比较大，然后前几个信号默认曲线还没有到上升期，但又上
下浮动）
以此为基数，然后减掉
这个时候如果你有比如16S rRNA的样做reference什么的
一般会在比较早就有Ct，比如Ct=5，或者Ct<10
那么前面的那个平均值就取得偏大了
就造成了曲线会“下降” |
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c****9
发帖数: 95 | 32 求牛人指导我怎么把文章的意义吹得高远，前无古人后无来者。我是测一个水域底的微
生物的SPECIES.用的是16S rRNA,结果得到这个生物的SPECIES比用别的方法测出的要更
多样化。请求大家教我怎么照着我老师的话吹嘘我的成果。谢谢。 |
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c********b
发帖数: 363 | 33 normally people use rRNA (like 18S or 28S) as a control, so run on is
general for RNA polymerase but not only for Pol II.
Run-on reflects how many active polymerases were binding to the gene-of-
interest at the moment the cells were freezed. So it can reflect the
transcription activity (I did not stay that it can tell the stability). And
of course, you know nothing is 100% in biology, right?
nuclear run-on, just google it, easy to find. It is not good for short genes
, because less space for pol... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 35 未知菌还是已知菌？
已知菌的话，如果菌不多，用几个pcr 不就可以了么？
如果多，点张个芯片，也很快，而且便宜。
如果有未知菌，只能测序了。不过如果菌不多，常规测序就可以了吧。
NGS 在metagenomcis 中的应用可能和你的需求有点相似。 |
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m******i
发帖数: 73 | 36 感谢!
粪便样品,想知道哪些肠内细菌变化了,应该是菌很多的情况吧.
我们不知道哪些会变化.
这种情况该如何入手?
再次感谢! |
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t*d
发帖数: 1290 | 37 这个估计只能芯片或者NGS了。
芯片的难处在设计探针。探针设计完以后，操作比较简单些，便宜。NGS 的难处在建库
，操作比较复杂。
总的说来，NGS 可能更适合些。 |
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m******i
发帖数: 73 | 39 你的意思是:
找一个识别16s RNA sequence 某个区域的通用引物.
然后PCR, 再然后测这些放大的序列 (可能有几百种菌).
我的理解对吗? |
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r*********r
发帖数: 6 | 41 “细菌变化”到底是指细菌种类的变化，还是数量的变化？
由于你的样品是许多混合的细菌，所以不能直接以SANGER法测序混杂的PCR产物。可以
用DGGE、SSCP、克隆、或pyrosequencing等方法，各有利弊，具体要看你想解决什么问
题。 |
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t*d
发帖数: 1290 | 42 不知道有没有商业化的。你可以查查Affy 的 phylochip，还有其他的一些panchip，
greenchip，MDA等等。不过这些芯片都有些年纪了，可能赶不上现在的形势了（越来越
多的细菌被测序）。
对于 NGS 建库，我指的是吧16s RNA 序列变成测序仪器可用的DNA 短片段之间的操作
过程。可以问问 BGI 接不接这个活吧。版上不是有 BGI 的兄弟么。 |
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m******i
发帖数: 73 | 43 我们都想知道:
细菌种类的变化
还有数量的变化
我上次听了一个seminar, 他们用的是 pyrosequencing,
我老板说得到数据不困难, 困难在如何分析解释上.
您能不能给科普一下大致的过程,难点和相关信息.多谢 |
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m******i
发帖数: 73 | 44 请问探针设计的难度主要在哪里?
如果知道了序列,找出特异性的20-40碱基序列是不是就可以了呢?
如果这个可行,可以尝试着自己设计序列,然后找公司做芯片.
因为我们可能只关注几百到1000个种类. |
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l******n
发帖数: 520 | 45 16S rDNA amplicon sequencing |
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t*d
发帖数: 1290 | 46 这个探针设计比较麻烦。
1）细菌16s RNA 的同源性很高，经常找不到非常特异的碱基序列。
2）芯片的分辨率不高，序列差异不太明显的话（比如相似性 > 80%)，可能都会出杂交
信号。
3）由于目标序列相似性太高，对于杂交条件要求比较严格，需要微调杂交液的组分、
杂交温度等参数。可是不同的探针适用的最佳杂交条件会有差异，所以设计探针的目标
之一是通过使用最少的探针来达到最大的分辨力。这时需要设计组合探针，最后通过几
十个探针的信号的来判读几千个菌种。
4）设计探针最好针对全长序列设计，但是NCBI数据中只有一部分所有的细菌的16s RNA
全长序列。 |
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m******i
发帖数: 73 | 47 虽然我的问题都很初级, 太感谢您的解答了.
探针设计,看来很复杂的东西, 比如说我想看1000个细菌, 如果
已知到他们的序列 (每个大概 3-400碱基序列),这种情况下,一般
您觉得需要多少个探针呢? 一般需要几个探针来确定一个细菌呢?
如果已知序列, 有没有什么软件,可以优化探针的设计?
另外的话,如果我们做454 pyrosequencing, 测序中心
给我的数据是什么格式的? 是fasta还是其他的呢?
是不是也会给出primer和barcode 的序列?
如果这些都有了, 有没有什么软件能比较样品组之间的细菌种类和强度的差别.
我听说有个东西叫Mothur,不知是干这个用的吗?
很抱歉,太多的问题,好不容易逮着您这个懂行的.
RNA |
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m******i
发帖数: 73 | 48 请问得到数据好如何处理?
老板说得到数据没问题,
但是我们不知道处理数据的流程是什么样子的.
您能否科普一二?
谢谢. |
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t*d
发帖数: 1290 | 49 16s RNA 的序列大概 1.6k 左右吧。如果过只有400左右多序列信息，很难设计探针。
比如说跟据A 菌的序列设计了一个探针 x，而且这个探针和 B 菌的400bp的序列不匹配
。但是我们不能说 探针x 和 B 菌不会杂交，因为也许探针x 和B菌的未知序列能匹配
上。所以探针 x 对于 B 菌就没有判读能力了。
测序最后拿到手的数据格式并不重要，因为肯定有方法转换成你想要的数据格式，这个
一点都不难。不过我对 NGS 的 metagenomics 不懂，希望班上牛人可以讲讲这方面的
东东。 |
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m******i
发帖数: 73 | 50 那比如说设计多个探针来检测同一个细菌, 假设我有 X,Y,Z 三个探针同时针对A,
只有全部结合,才算识别A. 这样的话,会降低误判的可能. 当然效率也低.
但如果只关注几百的细菌的话, 有无可能呢?
谢谢 |
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