t*d
发帖数: 1290 | 1 恩，你的方法可以降低误判的可能，但是无法消除误判的可能。
极端情况，A 菌的400bp在16sRNA的5'，B菌的400bp在3' 。这样针对A 的3条探针还是
可能都会和 B 菌的16sRNA 的5’匹配。 |
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m******i
发帖数: 73 | 2 是啊,消除不了误判阿.
那个phylochip是原理上怎么弄的呢?
他们自称可以识别几万种细菌, 他们还有个公司提供服务. |
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t*d
发帖数: 1290 | 3 我也不是很清楚 phylochip 怎么弄的。可能只做那些已有全长 16sRNA 的菌吧。有全
长或接近全长16sRNA的菌现在应该有好几十万株了。
另外，phylochip 也许不一定鉴定到种、亚种，也许鉴定到属就可以了？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 这个就是pyrotag sequencing
只不过pyrotag sequencing的通用引物上还放了barcode |
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m******i
发帖数: 73 | 6 请问放barcode序列是用来干什么?
数据处理时区分样品? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 对，就是用来区分样品的
另外也方便分拣出你的序列
比如有时候可以两个样品一起测
但是barcode不一样后期还是可以区分开来 |
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m******i
发帖数: 73 | 8 哦,原来是这样, 多谢.
那测完序的话, 他们会告诉你primer和barcode的序列,
然后,你就可以找出那些来自细菌的序列了,
但是,可不可能有相同序列来自多个测序片段, 如有, 那该怎么办呢?
另外,对测出来的序列,是不是有一定长度要求,比如说,50个碱基以下不考虑.
不好意思,问题太多,太蠢, 请多包含. |
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k*******s
发帖数: 214 | 10 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
序列。很浪费。
一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
列干净，可靠，全长 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 pyrotag sequencing怎么回事整个基因组的信息呢
都是用通用rDNA的primer先做PCR
放大variable region
然后再测的
做metagenomics之前一般也会先做个pyrotag 的trial
看看是不是值得做meta
rDNA |
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c**********e
发帖数: 70 | 12 请问你所说的做metagenomics之前做一个pyrotag的trial，看看是不是值得做
metagenomics，有什么参考文献吗？
我们最早的是PCR-单克隆-sanger，后来是PCR-454， 目前在考虑是不是做meta，因为
PCR的区域似乎不能提供我们希望的resolution，你所说的评价是否做meta是怎么一回
事啊？ |
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g******1
发帖数: 295 | 13 是所有fragments都用同一对primer对吗?
是不是加在5'端的叫forward primer，3'的叫reverse primer？
16S rRNA 测序时，我还看到一个概念叫universal primer,请问什么是什么意思？
谢谢！
is |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 total RNA or rRNA-depleted/polyA enriched RNAs, protocol pls... |
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A********2
发帖数: 107 | 16 Should be transcribed in the same direction as replication since they are
highly expressed genes |
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n******7
发帖数: 12463 | 17
PCR的error有一些，有些clone很奇怪，做了SANGER出来一些不知道哪里的序列。还有
rRNA的序列都弄出来了
我做的assembly，为了保证data size，有些cutoff设定的不是很严格，所以有些区域
的分值不高。还有一些alignment的问题，我发现过几个错误。 我们的目的是发现一些
新的iso，所以ref sequence并不是总有用。
保守没办法，我们的实验pipeline有些assumption，其实是不完全对的。加上我们最后
研究的使protein，这个对mrna序列太敏感了，只好保守一点。除非老板或者合作者愿
意做一些protein level的高通量严重，比如MS之类。。。
我们想发现全长isoform
RNA-seq目前只能研究splicing sites吧？ Cufflinks，scripture什么的出来的
isoform还是根据splicing site预测的，不一定真实存在。 做clone的目的也是为了
克服RNA-seq的这个缺点。我们选了一组gene set做的clone，手上几组数据大概一共测
序了36K的clone |
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b******n
发帖数: 4225 | 18 在细菌中，长达6.6kb的片段不coding任何东西很少见的
如果有，一般是rRNA
VIEW=Pairwi
10&FILTER=L
Translations&
OVERVIEW=on&UNGAP
blastn)
VIEW=Pairwi
10&FILTER=L
PROGRAM=blastn&S
HTTPGET=Yes&SH |
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k****o
发帖数: 589 | 19 以前提RNA做qPCR几乎从未失手过。最近用了一个抑制剂处理细胞，结果qPCR时目标基
因扩增很正常，用来参照的18S rRNA却扩增得很奇怪。具体说来是18S的PCR log phase
来得提前，有些样品的RFU干脆没有log phase，从一开始就一直线性增加。重新配制了
primer，问题没有解决。用以前的老样品跑18S，一切正常。这种情况可能是什么因素
引起的？ |
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c********b
发帖数: 363 | 21 "not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs"
This comments is universally right: all proteins encoding needs non-coding
RNA like tRNAs and rRNAs. So, not being specific leads to nowhere. |
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c********b
发帖数: 363 | 22 "not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs"
This comments is universally right: all proteins encoding needs non-coding
RNA like tRNAs and rRNAs. So, not being specific leads to nowhere. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 抛个砖
如果说得不太对还请搞这个方向的指正
species level
如果是16S rRNA conserved region的话，cut off好像是99％
如果用全长，cut off是97％ |
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w***y
发帖数: 493 | 24 我现在正在尝试从zebrafish embryo的total RNA里面提取mRNA， 用的是invitrogen的
Dynabeads和他们的mRNA purification kit。 按照他们的protocol做完后跑胶发现里
面还是有挺多rRNA。上网搜了一下发现有的人建议连续做2次protocol里说的
purification。 请问大家有什么建议么？
我试了一下发现第1次纯化后获得了大概3.8%的total RNA。第二次以后有1.5%的total
RNA。我不太确定这样连续2次purification会不会损失太多mRNA。 |
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m***o
发帖数: 272 | 25 用actin, GAPDH, TATA Binding protein(TBP), and 18s rRNA. Actin and tbp 显示
类似的降低，但是18s没变化。该选用那个来normalization呢？很多文章用18s，大家
用的时候是不是你的target gene 用1ulRT产物，而用18s的时候要稀释至少100倍呢，
不然Ct就在10，会不会因为量太高而显示不出该有的差异呢？作的是WT和knockout 老
鼠的liver，大家有没有什么好的建议？谢谢！
感觉选不好normalization， 做实验就好像有个定时炸弹在旁边一样不舒服。谢谢任何
建议！ |
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m***o
发帖数: 272 | 26 十分感谢！文章有些难，需要数学背景，打算再用文章里的UBC和rps18检测。如果都和
actin有类似的降低，说明那个样品就是低。用18SRNA总是觉得量太高，无法真正
normalization。而且18s是rRNA。 |
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m***m
发帖数: 1228 | 29 我现在这学校竟然没有这项服务,我想测测细菌16S rRNA 宏基因组,学校里只有
illumina,大家有没有比较推荐的公司或者学校,先谢谢了. |
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f*******2
发帖数: 14 | 30 If you are interested in sequencing the full-length 16s rRNA gene, PacBio
might be another choice. I have done some sequencing of 1.6Kb 16s RNA with
PacBio. So far data looks good. Let me know if you want more info. |
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S*********s
发帖数: 304 | 31 多选几个内参
b2m
18sRNA
GAPDH
看看内参之间是否一致。
一般尽量保证input RNA量是一样的 |
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a****n
发帖数: 79 | 32 18S RNA一般只用在northern blotting里做内参吧, RealtimePCR还是actin,GAPDH,
tublin做内参比较常见 |
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m***o
发帖数: 272 | 33 其实很多文献谈qPCR内参的。可以google一下。这里说一下我的体会。18sRNA 做内参
的一个确定是他不是mRNA,另外他的ct太小。但是有时他还是比较准确。比如我做不同
老鼠的脂肪组织就比较好。而且有片文献专门比较了脂肪组织不同的几个内参，发现
18RNA是最好的一个，而且 在dilute很多的cDNA里，发现变化也不是很大。
不过，我只是在找不到别的mRNA内参时用18sRNA.楼上说用GAPDH，actin，做内参，实
际GAPDH 不是个好的内参，很多时候会变化。我推荐用rpt18.不过再做自己样品时，是
要比较一下不同的内参的。搜搜版上，这个问题好像讨论过。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 34 谢谢你详细的意见，我最近几次的PCR中也发现，
18sRNA CT值只有8点多，但是确实很稳定，不同处理之间的变异几乎可以忽略。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 36 能有个定量的概念吗？就像RIN或者28S:18S这样的数值。
而且对于RT-PCR是针对特定基因的。不同基因可能结果不同。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 39 补充一个证据 rRNA
进化中最保守的遗传物质 |
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b******1
发帖数: 1116 | 40 以前学的细胞生物学，微生物学都换给老师了。。。求解答一下概念
1）细菌的菌种鉴定中，“细菌基因组DNA抽取”， 这个DNA是不是指核糖体DNA （rDNA
, Ribosomal DNA）？ 还是任何细胞内的DNA？
2）DNA抽取后采用PCR扩增，获得DNA序列 - 16S基因DNA，那这个16S基因DNA是特指
16s rDNA序列？还是只能用16S基因DNA这个笼统的表达方法？
3)扩增的是16s rRNA还是16s rDNA? |
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c********e
发帖数: 598 | 41 madhadron: A farewell to bioinformatics
I’m leaving bioinformatics to go work at a software company with more
technically ept people and for a lot more money. This seems like an
opportune time to set forth my accumulated wisdom and thoughts on
bioinformatics.
My attitude towards the subject after all my work in it can probably be best
summarized thus: “Fuck you, bioinformatics. Eat shit and die.”
Bioinformatics is an attempt to make molecular biology relevant to reality.
All the molecular biolog... 阅读全帖 |
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a***e
发帖数: 1010 | 42 顺便问一句，如果两个物种杂交，怎么检测表达的rRNA来源于谁。 |
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c*****u
发帖数: 357 | 43
做QPCR实际上用不着bioanalyzer，简单一点跑个胶就够了，qPCR之前一定要跑胶( 差
点打成泡脚)。。。
目的是看你的sample是否有降解，是否有DNA污染，你的nanodrop 读数高可能是因为污
染了phenol
你要拿到像楼上那种电泳图再做，要看到清晰的mRNA，rRNA带， |
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g********6
发帖数: 86 | 44 in vitro: 细菌表达GST融合蛋白，做GST pull down，可以用你提到的in vitro
transcribed rRNA，33P标记，完了之后做液闪。
in cell lines：转染HA/FLAG标记的蛋白表达质粒，做RNA immunoprecipitation，然
后做qPCR或RNA-seq。前面有人提到用CRISPR敲进标记，我觉得可能比较麻烦，不如用
质粒来的简单。当然最可信的方法还是用目的蛋白的抗体。 |
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y*****3
发帖数: 961 | 45 1，差100倍不太正常哦，如果不是测序公司稀释了，建议送到第三方去检查下。
2，如果降解的不太厉害，用去rRNA的方法还是可以建出很不错的library的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 46 关键看看内参的差别有多大。如果内参的量做出来差别不超过四倍的话我觉得是可以用
的。
另外，反转录起始的RNA量说明不了什么的，因为很多都是不能被oligo-dT反转录的东
西(rRNA,tRNA, etc.)。 |
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s****l
发帖数: 10462 | 47 Appl Environ Microbiol. 2014 Sep 26. pii: AEM.02206-14. [Epub ahead of print]
Performance comparison of Illumina and Ion Torrent Next-Generation
Sequencing Platforms for 16S rRNA-based Bacterial Community Profiling.
Salipante SJ1, Kawashima T2, Rosenthal C2, Hoogestraat DR2, Cummings LA2,
Sengupta DJ2, Harkins TT3, Cookson BT4, Hoffman NG1.
Thanks.
只好包子谢谢了。 |
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v*******e
发帖数: 11604 | 48
当然可以修改下理论，把细胞核翻译编译之类时间也计入。总之是：慢慢积累物资，然
后快速使用。不过如果不是因为神经细胞的特殊性（长），细胞核是可以进化成快速翻
译、编译之类的。比如rRNA需求量大，那么就有多个基因copy；有的虫类变态的时候
DNA链分裂成几百上千条，并行高速生产RNA。所以这个运输是决定性的条件，而细胞核
的翻译、编译解码之类的活动受到这个运输条件的限制，就不太快。 |
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J**a
发帖数: 215 | 49 最近才刚开始做RIP，用抗体从cell lysate里面pull down一个mRNA binding protein
以及和它有interaction的RNA，请问这样isolate出来的RNA里面一般rRNA和mRNA的
ratio大概是怎样的？和cell lysate的total input RNA相比，RIP出来的RNA product
里面是不是supposed应该很大幅度的enrich mRNA？
版上知道的大侠帮帮忙了，谢谢！ |
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w*e
发帖数: 740 | 50 rRNA和mRNA的ratio取决于你的抗体，
RIP出来的RNA应该比input RNA 富集很多倍。 |
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