s******y
发帖数: 28562 | 1 这个我不太同意。
首先，这两者的理论sensitivity的确差不多，而且在某种程度上来说，Sybr green因
为信号强度大，其实在检测上更容易被仪器看到。不过，你要是真的两者都做一次你就
知道了，对于含量特别低的样品，Sybr green的信号强度根本没有什么用，因为不同重
复孔跑出来的差别太大了（类似楼主看到的这个问题），导致那些跑出来的常常都是废
数据，所以真实的有效敏感度没有那么高。
另外，你可能对Taqman 的特异性的理解有些偏差。那个fluorescent probe, 要产生荧
光必须有两个条件：1，必须在template 上有PCR reaction 在进行； 2。probe 必须
能够结合在template 上面。必须两个条件同时满足，缺一不可，如果仅仅是probe非特
异结合是没有荧光的。
但是对于Sybr-green, 只要满足第一个条件就可以有信号了。
这样一来，Taqman qPCR 和Sybr-green 的特异性向比较就类似于Nested PCR 和普通
PCR的差别，前者在理论上肯定比后者更特异。
另外，Sybr-green 对于高Ct 的样品，光... 阅读全帖 |
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g******r
发帖数: 139 | 2 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
觉，SYBR的chemistry的稳定性不好，导致well之间跳跃性很大。而taqman assay 就没
有这个问题。
不知... 阅读全帖 |
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T*********n
发帖数: 309 | 3 1x SYBR Green I in real-time PCR = 1.96 uM.
Since SG I is sold as 10,000x, a preliminary dilution should be prepared in
DMSO (for greatear stability) before preparing your 10x buffer with 10x SYBR
Green I. Note that most SYBR master mixes contain extra magnesium. |
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T*********n
发帖数: 309 | 4 1x SYBR Green I in real-time PCR = 1.96 uM.
Since SG I is sold as 10,000x, a preliminary dilution should be prepared in
DMSO (for greatear stability) before preparing your 10x buffer with 10x SYBR
Green I. Note that most SYBR master mixes contain extra magnesium. |
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a******a
发帖数: 283 | 5 我的体会是SYBR的背景比taqman要大。是不是更加sensitive这个很难说，但是如果背
景很大的话，就容易出现无法读取低信号的问题。
taqman相对来说干净很多。我常用的对照样品，不是每次，但是基本上也是plate-to-
plate的差异很小，在0.3到0.8之间。
个人偏爱Taqman，觉得SYBR麻烦很多。尤其是最近出现的一系列问题，对SYBR失去耐心
了。 |
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g******r
发帖数: 139 | 6 Hi Sunny, 谢谢你的建议。我目前的情况是同一台机器对taqman assay可以handle Ct
33-34，而SYBR只能到25左右。尽管我做的不是一样的样品，但也许这两种方法之间的
差别还真就这么大。
不过我还对SYBR只能handle Ct around 25还是很吃惊，预期是３０左右吧。但你也这
么说，很可能就是这种技术的极限吧。
我用的是SYBR® Select Master Mix from Invitrogen，能改的条件是加大上样量
，退火温度和延伸温度。用目前的条件作全部的gene，得到大致的趋势。然后根据结果
再对有问题的gene加大量，以期得到更加可靠的结论。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
程度不一样。
如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
没那么大。
对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
新配更
浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
如果你真的有特殊原因要用SYBR，那么建议你直接搬用Taqman buffer（不加probe即可
），然后自己手工加SYBR-green and DMSO, 而不是从头优化Invitrogen buffer.
Ct |
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B******o
发帖数: 496 | 8 Sunny, 你的说法不正确。Sybr和Taqman在sensitivity上是一样的, Sybr green与
double strand DNA结合，而taqman依靠PCR酶酶切活性来使原本quench的fluorescent
dye发光。 ABI常宣称说Taqman更specific，因为需要probe和target sequence结合才
会被PCR酶切到。实际上，这个hybridization的过程也有non-specific binding的，它
并没有提高PCR本身的sensitivity，而只是免去了看melting curve的必要. Sybr
Green的方法结合melting curve在sensitivity上和taqman一样。
我临时查了一下就发现了很多文章表达了同样的看法，http://mic.sgmjournals.org.proxy1.athensams.net/content/149/1/269.short
很多人的bias仅仅是公司特意宣传下被欺骗了而已。
前面ArtyArty说的很中肯，楼主连自己primer的线性扩增好不好都没测过，显然在很多... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 638 | 9 理论上讲Taqman的特异性要高过sybr green，因为它只有在probe结合在PCR扩增的区间
才会有信号，PCR的non-specific amplification或者probe的non-specific binding两
者之一的情况都不会产生信号，而sybr green只要有非特异PCR扩增就会出信号
另外Taqman可以做internal control，一个孔同时测未知基因和housekeeping，可以降
低部分variation。
Taqman就是太贵了，一般做做实验sybr green也就差不多了，反正qPCR也就是一个data
，真要做solid肯定得有其他independent的方法验证。
fluorescent |
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b******k
发帖数: 1874 | 10 Hi, anyone have tried to increase annealing/extension Tm 5 degree higher
than default setting , when using ABI's Power SYBR® Green PCR Master
Mix to do realtime pcr? this is my first time to work with sybr green.
I designed a bunch of primers, and just found the Tm of all oligos (by
VECTOR NTI's oligo analysis) is 5 degree higher than that primer express 2.0
calculated.
Many thanks. |
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b***g
发帖数: 516 | 11 请问有人重复使用sybr safe么？invitrogen说不推荐，但是我想知道有人这么干不？
重复2－3次可以吗？毕竟sybr safe还蛮贵的。 谢谢！ |
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t******s
发帖数: 54 | 12 请问有谁知道这个常用的SYBRGreen1 10000x in DMSO 里SYBR Green 1 的浓度吗? 我
想知道如果我从Sybr green 固体自己配的话，应该用什么浓度。多谢。 |
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t******s
发帖数: 54 | 13 请问有谁知道这个常用的SYBRGreen1 10000x in DMSO 里SYBR Green 1 的浓度吗? 我
想知道如果我从Sybr green 固体自己配的话，应该用什么浓度。多谢。 |
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g******r
发帖数: 139 | 14 板子用的同一批次，应该是干净的。至于检验机器，这个是很可能。每次用这个
ABI7500 fast的时候都说什么calibration expried, do you want to continue (
something like this)。
但是相同时间下Taqman assay没有问题。是不是这个机器校正过期对SYBR的影响特别大
，但对Taqman assay没有什么影响呢？
但是确实这个可能是原因，也许需要做SYBR的校正，而taqman assay用其它的filter,
可能还不受影响。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 SYBR system 天生就比Taqman 的特异性差一些，在实践上，线性区间也差一些。但是
差别没有那么大。
你的问题主要应该是PCR condition 没有优化，检测的有效Ct区间不高。
注意你用的SYBR premix 和你的Taqman premix 不是同一个buffer, 不能直接比较优化
度。
大部分realtime PCR premix 的有效线形区间是12-25.对于高Ct sample误差变大的原
因主要是在那些区间的反应已经不再是线性，而是会受一些随机因素很大的影响。
我的建议是，加大你的样品的上量，尽量把有效Ct控制在30之内。如果你没有办法控制
上样量的话，那么就需要优化条件，去试探镁离子组合，dNTP含量，annealing
temperature, extension duration等等条件，把你的线性区间调到高Ct区。
cycle |
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l***s
发帖数: 841 | 16 SYBR Ct 35肯定就测不准了。一般不要超过33. 只要有RNA表达（哪怕很低），这个都
不应该是个问题。大多数读数都在30以下，很少超过32. Replicate之间误差一般在0.0
-0.2之间。 若Ct读数太高，大多情况下是primer设计的太糟糕，效率低下。每次我用
新primer之前，都要检验一下，确保效率，特异性都没问题。对于没用过的primers，
先跑QC，有问题的primer比例很低，只有10%左右需要重新设计。其实TaqMan对懒人来
说比较合适，因为primer，master mix什么的，条件都已经optimized,直接用就行了。
若经常做qPCR的，SYBR是即实惠又可靠的选择，完全没必要买那么贵的TaqMan assays。 |
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g******r
发帖数: 139 | 17 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1... 阅读全帖 |
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e**s
发帖数: 513 | 18 Does anybody use SYBR® Safe DNA gel stain? I am looking for a substitute
for Ebr. Please give some recommendations. Thanks a lot! |
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z*****6
发帖数: 1486 | 19 definitely good... I have used SYBR green from invitrogen. |
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a*****a
发帖数: 312 | 20 per my boss:
SYBR dyes are new and there is insufficient study on whether they are safe.
substitute |
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a******a
发帖数: 283 | 21 Here is a technology question. I know it should be possible to improve the
result and would like to hear some more suggestions.
Basically we are trying to push the limit of detection to the level of 10e4
or even 10e3, for viral RNA isolated from animal blood samples, for
pharmacokinetic study.
Our samples contain mostly carrier RNA with viral RNA of interest.
And with SBYR or TaqMan, we can stably detect 200-300 copies per well (of 96
-well setting), that translates into 10e5 copies/ml with our ... 阅读全帖 |
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t******s
发帖数: 54 | 22 非常感谢TIRecursion的解答。
in
SYBR |
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B******o
发帖数: 496 | 23 if your gene is very lowly expressed, big variations between replicates can
be possible. Otherwise, it is the way you handle the sample that causes the
problem.
Sybr Green assay is as sensitive as Taqman assay. I don't think ABI(life
tech)'s claim is true that Taqman is more sensitive.
cycle |
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g******r
发帖数: 139 | 24 这里不是sensitivity的问题，是同一样品的replicates之间有较大的误差。至于样品
操作，我对我的所有加样步骤有信心，可以排除。
我问过旁边实验室一个同事，他只用过SYBR，这个问题也常常出现。而我作了6个
taqman assay的plate，没有一个well是outlier.
can
the |
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a***y
发帖数: 19743 | 25 用过taqman也用过SYBR
没有感觉有明显差异。
感觉是你的机器，或者加样上面的问题。
cycle |
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P***w
发帖数: 67 | 26 看了一圈回复，悲哀，这个版的理论水平在持续下滑。
楼主先去搞懂taqman, SYBR的原理，然后再讨论什么能造成variation |
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g******r
发帖数: 139 | 27 牛人都不发言，当然水平就下滑了。只是所谓Taqman,SYBR的原理还是知道的。 |
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g******r
发帖数: 139 | 28 谢谢，可能是机器需要SYBR的校正。等作完校正后再比较一下。 |
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w*****y
发帖数: 1201 | 29 你用的是谁家的SYBR，你的primer特异性如何？
cycle |
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g******r
发帖数: 139 | 30 Invitrogen的SYBR® Select Master Mix。
我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
product,怎么解释replicate well之间的差异呢？ |
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w*****y
发帖数: 1201 | 31 我的理解是，SYBR是针对所有dsDNA，特异性要求比较高，我一般设计primer的时候，
会设计primer cross exon-intron splicing site，这样即使RNA有轻微的DNA污染，不
会对结果有影响，你的primer是如何设计的？ |
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g******r
发帖数: 139 | 32 OK,what you mean is the cDNA concentration used should be in the linear
region of the reaction.
This concentration would vary for each of the genes, dependent on the
abundance. I did not perform such cDNA dilution pilot experiment for each
gene. I just used 2-4 ng cDNA in the real-time PCR. One would assume the
gene with Ct of 25-31 is within the linear range, if the Ct is >33, it is
possible the cDNA conc is kind of out the range.
And it is true as Isaid that I got no outlier replicates for gen... 阅读全帖 |
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A******y
发帖数: 2041 | 34 Are you telling me that you did not validate your primer amplification
efficiency? You input cDNA is total cDNA, you don't need to adjust every
time, but you do need to check your primer linearity and amplification
efficiency. If you didn't, please tell that to the reviewers, lol. Btw, I
have seen primers that are good in taqman that are completely useless in
SYBR rxn.
Btw, show me you actually validate your amplification efficiency and
linearity before we keep talking.
low
still |
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B******o
发帖数: 496 | 35 probe's non-specific binding can generate signal as well, as long as the
amplified DNA has similar sequence that can hybridize with the probe. It
really depends on how the probe is designed.
As for Sybr Green assay, it is necessary to check melting curve every time.
If any non-specific amplification were present, the curve wont be a single
peak.
data |
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a******a
发帖数: 283 | 36 胖头鱼先生能不能分享一下手动加SYBR green的体会和心得？我从来没这么做过，很好
奇。
谢谢！ |
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g******r
发帖数: 139 | 37 上Taqman,呵呵。用SYBR你有知道可靠的primer,error bar也很小，或者重复性很好，
结果也是可以用的。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 38 新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
温度已测好，57°C
用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
25μl total volume
12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
用的PCR program如下：
95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
curve
72°C elongation step读数
结果没有任何信号，dissociation curve当然也没信号或者有一些非常弱且杂乱的信号
我把sample拿出来，跑了个2%agar gel，结果非常清晰干净的一条带，size完全正确，
看不到primer dimer或者其他non-specific ... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 39 哦，那跑完SYBR PCR能不能直接跑胶，不要用EB？
一般UV应该可以看到条带的。如果直接看SYBR看不到，再用EB染一下，如果能看到，说
明SYBR有问题。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 40 推荐是用sybr green 2染单链，
不过用sybr gold和sybr safe也都能染出来 |
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A******y
发帖数: 2041 | 41 If you use taqman, it is unlikely you can use the sybr green primer. There
are RT-PCR primer library these days, just use sybr-green and use the primer
from the library. Also, you need to use multiple house keeping genes these
days. |
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c******r
发帖数: 3778 | 42 sybr green也可以，但是需要分开跑。
sybr green是个non-specific的DNA double strain dye.就是说，只要是PCR产物都可
以stain。所以没法用multiplex reation做internal control。
如果用taqman，pcr效率不错的话，可以设计两对primers，一对测你的target
sequence，一对做个其他随便什么基因的sequence。分别用不同的颜色标记。这样在一
个样品里跑两个pcr。如果如果target sequence是control的50%（一般给+-20%的误差
）就是single copy。如果和control一样（也是20%误差）就是two copies。
如果你的primers设计比较好，两对的amplification efficiency非常接近，那么可以
直接用ct数来计算二者的关系。但是如果两对primers的效率相差比较多，那么只能每
次都分别给两个primer做standard curve。这样保证二者的定量可比，也是可以的。就
是麻烦点。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 43 问一句，你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
sybr mix是多少乘的？
另外你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？ |
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f*********r
发帖数: 1233 | 44 我替楼主回答这些问题:
你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
答：是EB
sybr mix是多少乘的？
答：2x
你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
答：55-95度。每个梯度0.5度，共80个梯度。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 45 问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)
dissociation |
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a******7
发帖数: 7936 | 46 是一个96孔板只能做一个样品么？
老板给我的盒子里就两个板啊，一个做control一个做处理的，就没了。。。。没有重复
实验室只有abcam的Sybr Green，能用么？还是要另外定 SYBR Green mastermix?
cDNA的浓度有没有要求？mRNA reverse transcript以后一般是稀释10倍就可以了么？
谢谢！~ |
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i*****i
发帖数: 154 | 47 对于qPCR定量，参考下面这个链接：
http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/e4a1cd4c-9293-
或者放狗
Sequencing Library qPCR Quantification Guide - Support - Illumina
或者看看 KAPA Library Quant Kits
最好用KAPA的SYBR来做，便宜的 例如 Promega的SYBR干不了这么高端的活。
其实就是用通用引物来做PCR。
Reference genome应该是用来做mapping的吧。具体的我也不是很清楚，
你可以参考liu xiaole的网站，或者galaxy的教程 |
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m**o
发帖数: 1313 | 48 现在SYBR SAFE $47 400 ul, 也是10000x，老板都说贵。。我今天拿到一个叫做
Midori Green Advance的quote,算下来相当于1/3的SYBR SAFE价格。我定了个sample试
试先。看网上评价还行 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 49 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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