s*k
发帖数: 144 | 1 请允许我这个半瓶醋插两句嘴:-)
大家知道在细菌里染色体是环形的,质粒也是环形的.
那么当它们复制的时候,到了最后关头,就会形成一种
两环互相套在一起的局面. (这个在数学上好象叫knot
我不大敢肯定,希望专家指正) 这时候,正是Topo II
挺身而出,解决了这一尴尬局面,将两个环彻底分离.
ATP若是参与到这个反应,没看文献,按照我的猜测可能
用于断开双链DNA,即形成一个dsDNA-->2ATP的中间体,
以打断DNA.当另一双链DNA穿过dsDNA的断端,酶再将
ATP水解会来,所以整个反应没有ATP的净消耗.
现在教主面临的问题是:
反应既然没有能量的消耗,为什么反应产物却不是处于
统计上的平均分布?
Roca 的工作从酶的作用机理和DNA的超螺旋性上这一
微观角度来解释这一问题.
而教主的工作是从热力学和分子动力学这一宏观角度
解释这一问题.
不知道以上我的这些说法是不是漏洞百出,还请专家斧正. |
|
|
s*******y
发帖数: 2366 | 3 我也总是先TOPO TA
PCR产物酶切效果总是不好:( |
|
t******r
发帖数: 8600 | 4 Invitrogen has some good stuff, like Topo, etc. But, most of its products
have very poor quality, I guess they
are getting too big and there are tons of garbage startups sequeeze their
poor products onto their shelf.
BAD!!!
The bad stuff I have used recently:
Stbl2 & 6
DNA ligase
Cre recombinase
RE enzymes
...
...
For cloning, NEB products are the most reliable. |
|
A**E
发帖数: 191 | 5 For enzymes NEB is always the first choice.
However, Invitrogen's TOPO cloning kit is very convenient indeed. And
efficiency is quite high in my hands. |
|
A**E
发帖数: 191 | 6 Thanks for sharing! This is their own product (not through acquisition), and
I am surprised that their QC has such big issues.
Anyway, I am still using my old TOPO (blunt-end) kit ordered ~2 years ago...
Seems to be working well, still (fingers crossed). |
|
t*****z
发帖数: 1598 | 7 喜欢Fermentas的酶。RE都换成FastDigest格式的，全部缓冲液通用，和其他修饰酶也
可以通用，做什么都不用换缓冲液，而且连loading dye也给你加好了，非常适合我这
种懒人。T4连接酶，号称室温五分钟（我没试过这么短的）。
克隆载体方面Fermentas有个pJET，便宜又好用，传统的平端T4连接，但是效率很高，
我每次只连15-30分钟，就长出很多克隆。阳性率100%，假阳性率0%，我有时甚至都可
以省下筛选这一步，直接养菌抽质粒了。美中不足的是载体上的常见的酶切位点少了点
。与之相比的QIAGEN的pDrive，也挺好用，但是阳性率不是那么高，。每次还是不得不
挑那么四五个菌落来做PCR鉴定。Invitrogen的TOPO TA载体们，我们实验室和隔壁实验
室用起来都很不顺利，我现在弃之不用。
Invitrogen的Gateway载体们，虽然贵，没办法，只能买他们的，感觉Gateway这么方便
的东西还是只此一家。效率不高，有时会出问题，但是勉强够用了。我曾自己试图构建
类似于pDONR的载体，失败，原因复杂，一言难尽。不喜欢NTI，宁可用最土的BioEdit |
|
g***y
发帖数: 201 | 8 看来看去，觉得问题很可能在片段1上。
你的片段1是怎么得到的呢？
有没可能你的片断末端跟你假设的不符？
比如假设是，EcoR1-片段1-Nhe1
其实是EcoR1-片段1-EcoR1－－如果你的片断1原来是在topo里面，就杯具了,除非是pcr primer末端加上nhe1位点。 |
|
|
M****m
发帖数: 2142 | 10 酶切后我的gene 是3.3 vector是 3.4，该怎么跑胶才能把他俩分开我好回收我的片断
？我用的PcR-XL-TOPO，vector其他区域有没有可以被酶切的这样vector size变小就可
以回收我的片断了？或者跑0.5%的DNA gel跑远些 可行吗？ |
|
y******8
发帖数: 1764 | 11 check the PcR-XL-TOPO vector sequence. |
|
a****k
发帖数: 1130 | 12 是应该浓度大一点来分，前阵子也遇到同样的问题，Topo-XL和一个3kb多一点的基因，
我们postdoc试了0.6%左右的胶，结果根本分不开，反而后来我们用了1%还是稍微再高一
点的就分开了。另外，vector的sequence网上没有吗？ |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 13 有个4kb的片段比较难amplify
好不容易折腾得可以P出来了
然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
5'端好几次都给我奇怪的结果：
amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
所以能看到back bone）：
5'TTAGGCCGGCC.....
我得到的就是这样：
5'GCCGGCC......
本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
直接导致一个限制性酶切位点不完全
primer是IDT定的
从IDT订过可能有上千的primer，从来没有遇到过这样的情况
现在我不知道是primer的问题还是有什么别的原因
版上有人遇到过么？
当然我准备定新的primer看看有没有帮助
不过还是百思不得其解这是怎么回事啊 |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 14 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
里面是否可以看到TOPO II的部分序
列。
我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
思？不能切开还是不能完全切开？ |
|
b********c
发帖数: 161 | 15 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
|
b********c
发帖数: 161 | 16 我测过序列从T7开始到基因结束没有什么问题.
我老板闲GST-tag太大了,所以想去掉,就重新克隆到TOPO里面了.
难道是因为没有GST-tag,蛋白质就有毒了? |
|
a******n
发帖数: 167 | 17 Use 1 specific primer and 1 degenerate primer to do PCR then TOPO-clone.
Btw, try UCSC if you are cloning human/mouse genes. |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 18 对于你说的IDT很不错我要提醒一下
大多数时候IDT很不错
又快又好
不过我说的是一般情况
我自己就遇到过两次从IDT订引物然后很失败的
1.就是上次在版上问的PCR然后TOPO克隆出来以后发现引物5'端位置比设计少了几个nts
，结果造成少
了一个限制性酶切位点；我重新定引物，就好了；
2.是以前做primer extension的时候，因为这个对纯度要求比较高，要统一长度，订的
是要求HPLC
纯化的，结果不要说等了很久，拿到手量也少，等我P32标记以后跑了个胶确认一下，
居然发现有三条
带。从那次以后我做primer extension的时候都是订普通的salt free，买来自己跑个
PAGE胶切下
来纯化一下，又快又便宜。 |
|
F*******2
发帖数: 103 | 19 想把蛋白序列克隆到一个有his-tag，有tev site, 有t7-promoter，最好还是iptg
inducible expression的vector上，看了invitrogen有合适的TOPO-TA-vector，但是好
贵啊，大家有什么推荐不？ |
|
s********n
发帖数: 2939 | 20 不是很了解来龙去脉，你是没有带有不同tags的载体么？这样做克隆效率当然会很低啊。
如果你下一次做类似的课题，我建议你用Gateway cloning system，只需要将你的基因
克隆到pENTR vector（RE cloning，LIC cloning, TOPO cloning or BR
recombination），然后你就可以随意的将你的基因克隆到其他带有不同tag的pDEST
vectors上了，效率很高。
其他的还有ligation independent cloning (T4 DNAPol)和In-fusion cloning。 |
|
k*****u
发帖数: 14053 | 21 最近做一个克隆
2。5kb得转到topo vector里
然后电转进一个ecoli cell， which has a temperature sensitive plasmid already
然后只能在30度长， 2个抗性
板长2－3天
streak for single colony
然后挑single colony 进液体
28度长2天
做小抽 （qiagen）将近20个sample了每次只有10－16ng/ul in total 30ul
正常么
告知师兄（埃及人）
说了我不觉得自己手有问题 以前都抽过其他得还有大抽genomic dna 都没问题
结果他offer明天和我一起做小抽
唉 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 22 恩，做什么什么不work
比如三个TOPO-blunt end克隆
各挑了八个检测
只有一个连进去了
再比如今天做anti-GST的WB
sigma买的
用的E. coli lysate
结果背景怎么那么多啊
uninduced和induced cell看起来一模一样的
N多条条带
mmd
有谁用sigma的anti-GST？ |
|
g*****e
发帖数: 209 | 23 topo这个效率也偏低啊，是不是pcr产物不新鲜？ |
|
c****1
发帖数: 1095 | 24 直接测序片段，要设计引物，这个就有不确定性。连到T-easy或者TOPO载体，用T7，很
方便。 |
|
z*t
发帖数: 863 | 25 谢谢:)那您是用topo cloning还是attB PCR product? |
|
s*******n
发帖数: 37 | 26 最近做了一个small rna library(~40-60 bp)，adaptor ligation, cDNA ，ＰＣＲ，
gel purification 做的都没问题，在送去大规模测序前想做个Topo-TA cloning, 先挑
几个克隆测测，做了两次都没什么真的克隆，也就十几个，不知道板上有没有人有这方
面的经验。谢谢。 |
|
C*****h
发帖数: 926 | 27 不要用Topo-TA cloning。
这是我用过的，世界上最差的cloning kit。 |
|
s*******n
发帖数: 37 | 28 除了Topo-TA cloning 还有什么好的系统？ |
|
g*******8
发帖数: 6 | 29 既然可以用pcr product和primer直接做sequencing，那为什么有时还要用TOPO
cloning先clone，然后再做RCA， 最后用RCA product 和primer来做sequencing呢？
多谢指教！ |
|
n***w
发帖数: 2405 | 30 PCR product is a heterogenous population which contains many copies of DNA.
Sequencing may give you false positive result. BTW, if you just send PCR
product and primers for sequencing, you cannot get full length (you will
lose ~60 at both ends.)
But after TOPO cloning, it only contains single copy of DNA. |
|
g*******8
发帖数: 6 | 31 Thanks so much for your reply!
But if so, why most time we still do core sequencing (directly use pcr
product and primer to do sequencing)? Could you please tell me when should
we do core sequencing and when should we do TOPO cloning and then sequencing
?
Thanks again! |
|
G***y
发帖数: 1082 | 32 If you use the TOPO kit, it's ~10$ per reaction and ~a day and half's extra
time. It roughly doubles your cost and time for each sample. You have to
decide if it's worth the trouble/money based on your experiment.
should
sequencing |
|
s********8
发帖数: 619 | 33 头一次听说topo blunt end呀.这个你最大连过多大的片段? |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 34 hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
每个fragment大概0.8-1.1kb
然后我做的是pUC19 50 ng,
pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
总体积15-20 ul
ligate 20 hrs
然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
涂100-200 ul/平板
然后挑克隆
用colony digestion筛选
一起做了五个ligation
一天筛了近90个克隆
每个ligation都筛出正确的了
然后这些positive的提质粒出来
用不同的酶切再确认一下
然后测个序（或者不测）
直接PCR的切就行
不过我个人比较喜欢的是每个片段先做到TOPO里面（pBluntII)
先测序
挑序列正确的再酶切、胶纯化，往下做
这样每一步都是正确的序列
最后终产物酶切什么都对的话不测序也没关系
不然如果... 阅读全帖 |
|
B******o
发帖数: 496 | 35 可以用 TOPO blunt end cloning先做了再转嘛
按照phusion的说明书，你得纯化。至于加A overhang的效率咋样，俺就不清楚了 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 36 probably TOPO from Invitrogen. |
|
s********8
发帖数: 619 | 37 这样啊,可是topo 的manual上说的是加dATP啊?
下次试试dNTP吧! |
|
b**********8
发帖数: 349 | 38 那个棒棒糖图啊，参考这个链接
http://www.dxy.cn/bbs/thread/15900186?keywords=BSP#15900186
BSP 主要目的是，通过测定亚硫酸盐修饰后的DNA序列，了解特定基因的具体CpG位点的
甲基化情况。而MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息，BSP则可以详细了解每一个
CpG位点的甲基化情况。
1，首先，按前帖设计引物后，确定BSP反应条件。我们实验室一般都做45个cycle.
提个有意思的题外话，通常BSP的退货温度，会比相应的MSP的退货温度低。
2，BSPCR后，取10ul跑PCR，如条带单一，则直接克隆，具体操作按照Invitrogen的
TOPO试剂盒进行；如条带有杂带，需要进行PCR Screen，具体操作及原理以后再讲；
3，克隆后在LB胶上，培养过夜后，后通常取8-12个克隆，LB培养过夜；
4，过夜后LB液浑浊；按照5-Primer的Mini Plasmid DNA提取试剂盒操作说明，提取质
粒DNA；
5，半量反应后，送Genomic Core测序；
6，测序结果报告用FinchTV软件阅读(可用GOOGLE搜索后... 阅读全帖 |
|
b******n
发帖数: 4225 | 39 先连到T-easy或者Topo等克隆载体上面再做亚克隆吧
你想克隆的片段多大？ |
|
B*********r
发帖数: 19 | 40 感谢诸位的意见！
本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
是case by case了吧。
PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢
唉，看来还是干实验比较轻松愉快，湿实验太揪心了。。。 |
|
r******y
发帖数: 21907 | 41 我用的是NEB Phusion HF MM做的PCR 然后直接用去TA cloning了 后来一看这种应该是
blunt end 可是我竟然得到很多克隆 提了质粒送去测序也正确 可是理论上应该连接不
上才对啊 因为没有那个A 谁能解释一下这是咋回事儿？难道是因为我的gene最后一个
是A？@@ |
|
r******y
发帖数: 21907 | 42 也不对 那个A也不是overhanging的。。。 |
|
j***l
发帖数: 69 | 43 如果测序结果显示PCR产物3‘端的确多出一个A的话，那只能说明你用的酶本来就可以
在PCR末端多加一个A，虽然它的产物大部分都是blunt end的。 |
|
b****r
发帖数: 17995 | 44 本来就没有绝对的吧，没有overhang只是说大大降低效率，还是有连得上的 |
|
q**********0
发帖数: 335 | 45 Recently I tried three different TA cloning Kits from Invitrogen (TA cloning
, TOPO TA clong and dual promoter TA cloning). I found all of them have very
high self-ligation rate (>90%). I don't know anybody have similar results?
Any suggestions for other better choice for TA clone? Thanks. |
|
W*********n
发帖数: 775 | 46 PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
可能原因：
1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
颜色没有变化，感觉应该没有问题
2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
大家分析下，问题出在哪里？ 全都换掉有些浪费。 |
|
b******n
发帖数: 4225 | 47 用高保真酶扩，可以做blunt end ligation或者用topo之类基于isomerase连到载体上 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 48 对了，条带弱一点也可以做TOPO blunt end cloning的
用电转化
应该没什么问题 |
|
|
C*******e
发帖数: 4348 | 50 模版是什么？
cDNA？
细菌gDNA?
人／老鼠gDNA?
用过takara的LA(long and accurate)
扩～12kb，细菌gDNA
然后TOPO blunt end
测序，20个里面拿到一个全长都正确的
不过这是几年前
现在不知道哪一家long amplification做得最好
虽然每家都说自己的最好LOL |
|
