发帖数: 1 | 1 这种层次差异可以有三种。
一种是对外星人光速根本不是限制，也就不需要受光速限制的电磁信号来通信。这样，
你回电磁信号也没有人监听。人类从可以监听宇宙电磁信号以来，几乎没有收到任何
有意义的信号，这件事本身就表明，宇宙上其他生物，绝大多数是不靠人类的这种电
磁信号通信的-要不然监听站还不得跟短波收音机似的。这种外星人，宇宙旅行想到哪
里，看什么样的星球或生物，说到就到了。
一种是对外星人来讲，地球就如动物园一样，或者我们所知的人类地球干脆就是外星
人实验室培养液中的微生物。这样，谁会去和实验室里的微生物去通信，或者“危害”
这些微生物。
一种是对外星人来讲，地球就如同外星人的游戏场，地球和人类是虚拟现实（精细到
DNA和原子的设计）的产物，外星人可以代入地球人生命角色游戏人生，就像现在的
小孩玩带角色的网络游戏一样。这种，根本也谈不上和地球生物沟通，本来就是一个
本源。 |
|
r****o
发帖数: 105 | 2 让我猜一猜，你是想用类似CO-IP的方法把与某个蛋白有相互
作用的其他蛋白找出来把？
一般来说只要你纯化出来的蛋白跑SDS-PAGE后银染之后能看见
条带就行了(至少纳克级)，就可以把胶送去做质谱了。建议你从
最简单的10厘米直径培养皿养细胞开始试起。可以多养几盘，如果你
觉得蛋白量不够。不过不要一下子就想用成升成升的悬浮培养，：-)
会很麻烦的，你又不是想长晶体。
做悬浮培养最常见的是CHO细胞。养这种细胞的技术很成熟了，
还有专门的无血清培养悬浮CHO细胞的培养液卖。随便问一个做tissue
culture的人都会知道的。
前面有人说用bioreactor.其实连这个都不用，用那种有磁转子的
培养瓶(体积大概是一两升)，或者滚瓶都可以。 |
|
t****p
发帖数: 1504 | 3 最近刚参加了一个Cold Spring Harbor的会议，听到一个talk，觉得真是激动人心。特
此跟大家分享一下。
简单的来说，就是质谱能够鉴别磷酸化的peptide，如果分辨率够高，加上定量，那么
就可以看到整个细胞在某种刺激下蛋白磷酸化随着时间的动态变化。
关键词：
定量的实现：假设同时培养两盘细胞，一盘是正常的培养液，一盘含有稳定重同位素的
arginine和lysine。第一盘加EGF，第二盘对照。如果把两盘细胞等量混合，就可以 看
到某个磷酸化peptide的相对变化。
富集：TiO2可以特异地富集磷酸化的peptide。
分辨率和灵敏度：是不是所有可被磷酸化的peptide都可以被检测到呢？由于人们无法
估计总共有多少磷酸化的peptide，所以不知道能cover百分之几。总之大概有10000个
磷酸化的peptide被检测到。
多点磷酸化：也可以看到。甚至是某个位点的磷酸化依赖于另外一个位点，也可能获得
信息。
定位：把蛋白分为胞质蛋白和核蛋白，可以提供蛋白磷酸化后穿梭细胞核的信息。
时间动态：比如加入EGF，处理不同时间。
Cluster：把磷酸化动态变化相似的蛋白 |
|
N******o
发帖数: 3053 | 4 如果你需要细胞密度很高做实验的话，可以先多个Plate养，然后收集起来加到
RetroNectin（Takarabio，Japan)修饰Plate上面。
RetroNectin个破东西超级厉害，当然也是超级贵，你只有用高浓度Trypsin才能剥离细
胞，而且剥离后一定加入PBS冲开细胞，如果你加入培养液，里面的血清中和Trypsin以
后细胞又被RetroNectin粘上去了。 |
|
a******n
发帖数: 392 | 5 做的是胚胎干细胞。有什么讲究的没有，除了用低血清培养液之外？一般都要加什么增加
transduction效率的辅助物质呢？对细胞生长的状况有什么要求？ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 你确定那个配方里真的就是这么写的么？如果你们是要配植物细胞的培养液的话，
就像另外一个同学讲的那样，可以用钼酸盐来配。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 7 我仔细回想了一下。大概是这样的，在第三天的时候，细胞是灰色的，培养液是黄色的
带有一点黑，
但是并不会真的很黑。因为B16 F10 cell line分泌的黑色素其实不是很多，在溶液里
面的浓度
不会特别大。如果这个溶液的颜色对你们很重要的话，你们应该用spectrometry 来检视
达到
溶液了 |
|
r******m
发帖数: 5550 | 8 怪不得我从来没有见过培养液变黑
我们的细胞都是顶多等90%满就分，长过了就不能用了
换溶液了 |
|
w*****g
发帖数: 20 | 9 我今天看了下说明书，上面说的不要在培养液里面放抗生素。
我没有做过实验对比。
你养的什么细胞，可能不同细胞有差异的。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 10 就像你说的，要具体情况个别分析
我没一杆子打翻一船的人
实验室一年就用20管感受态，那当然是买划算
如果像我们这种三天两头要买感受态，一个月大概要花$1000在这上面的呢？
如果你要一天200个平板，定得更make sense
（我说称重是说LB培养液哈，和那种premix的LB Broth Powder比）
我说的是有时候随手就能省的事情，可以多做做
假如有一天谁要海归，没那么多经费的时候，是不是也会采用这样的策略呢 |
|
l*****o
发帖数: 6 | 11 把细胞培养在P75瓶子，大约20％－30％满得时候（取决于细胞系种类），给P75瓶子灌
满培养液, parafilm封好瓶子口，然后用胶带固定好放在泡沫塑料保护的fedex盒子里；
注意1）计算好时间，北美周一／二发出，保证国内周五前受到；
2）国内通关手续应该事先办理好。
good luck! |
|
v***a
发帖数: 1242 | 12 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
胞膜上。
最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
缘故。
两个单抗都是raised against此蛋白的胞外域，而两个多抗是against胞内域。但是不
清楚为什么单抗就检测不出full length的蛋白（现在想可能因为mAb无法识别full
length的conformation？大家觉得这个猜测对吗？）
现在开始做in vitro的细胞培养， |
|
s******y
发帖数: 28562 | 13 关于你的那个单抗检测不到full length 的情况，其实很有可能是你上样量的问题。很
多这些蛋白，在某些条件下是以cleaved form 为主，full length非常少，而且有些情
况下，外面的那段一旦被切了，会导致胞内的那一段很快被降解。 所以你的样品里大
部分带都是体外的那一段。但是如果你提高上样量的话，用那些检测体外段的单抗叶也
能看到很小的一条full length.
至于那个多抗，因为它只检测full length, 对体外的那一段视而不见，所以在适当的
稀释度下可以看到full length.
至于第二个问题，有几个可能，一个是这个蛋白经过其他修饰之后可以被分泌出去，所
以用多抗可以看到一个不同的分子量的带。另外一个可能就是培养液里面的死细胞被降
解的残片。要分辨着两个情况的话有很多方法，你具体和你的老板讨论吧。我就不多讲
了。 |
|
m*****s
发帖数: 2227 | 14 早就有人说了
把细胞，培养液 放在冻存管里，要装满。
细胞不要太浓，很多人这么带回去的 |
|
l***d
发帖数: 1828 | 15 很有意思的科普文章
http://www.ccthere.com/article/3107327
[诺贝尔2010]爱德华兹：试管婴儿荆棘路 [ 游识猷 ]
新鲜出炉的诺贝尔物理学奖两名获奖者加起来一共87岁，而新科诺贝尔生理学奖得主罗
伯特·爱德华兹（Robert Edwards）一人就85岁，由于健康状况欠佳，诺贝尔委员会甚
至无法直接向他道贺，他的夫人露丝·福勒（Ruth Fowler）在得知获奖消息后代他表
达了喜悦之情。
爱德华兹——试管婴儿之父、剑桥大学退休教授、英国皇家学会会员、2001年拉斯克临
床医学奖得主、2010年诺贝尔生理学奖得主。他将独享一千万瑞典克朗（将近一百五十
万美元）的奖金——主要是因为另一名重要的合作者，产科医生帕特里克·斯特普托（
Patrick Steptoe）早在1988年便撒手人寰，假如斯特普托能活到今天分享诺贝尔奖，
该有97岁了——你看，要活到拿诺贝尔生理学奖的确是一件不容易的事情。
这个诺贝尔奖，爱德华兹可说受之无愧——首先，活到今天不容易；另一方面，整个研
究过程也是相当之曲折。
爱德华兹，1925年9月27日生于英国曼彻斯特。上个世... 阅读全帖 |
|
|
r******m
发帖数: 10 | 17 Thank you!
那用lentivirus transfect 过的细胞的培养液危险吗？Image细胞的时候有时候会洒到
外面又不知道。 |
|
p****l
发帖数: 291 | 18 你可以在培养液里加Brdu吧，过段时间看增殖情况
不过最简单的，数数细胞就好了，多了显然是分裂出来的呀 |
|
m*********7
发帖数: 606 | 19 现在才来为这个话题添砖加瓦，似乎有些太晚了。不过，实在是读到1978年8月柳
叶刀杂志上的原文时，受到的震撼过于巨大，拖了好长时间还是觉得不吐不快。
听到今年的获奖人后，我在第一时间向图书馆发出了获取该论文（1978年8月12日
柳叶刀杂志第366页）电子版的要求。两天后就收到了此文章的扫描版。打开后，我硬
是愣了半天，才意识到，原来这短短的两段话，占不满1/2页的341个单词，就是这一划
时代的贡献的记录。相比如今动辄十几二十几页的学术论文（以至于不少杂志都不得不
出台字数图表限制规定），这一篇通讯，简洁至极，也谦逊至极。现将全文中文录入，
与君共享 （注：题目中出现的“成功”，以及第一句中出现的“首例人类再植胚胎的
成功诞生”都为译者添加，并未在英文原文中出现； 另，因非医学专业出身，水平有
限，错误之处望请指正）。
人类再植胚胎的成功诞生
阁下，我们在此向您报告首例人类再植胚胎的成功诞生：我们的一位病
人，一位30岁未生产过的已婚女子，于1978年7月25日，经剖腹产安全产下一个正常健
康的女婴，体重为2700克。该病人经人介绍，于19... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 20 正在看。
她们认为该细菌仍然是用DNA system, 唯一不同的是磷被砷代替了
因为：
１。该细菌可以在没有磷的培养液里生长
２。提取出来的DNA含有大量的砷 |
|
d**p
发帖数: 149 | 21 培养液里没有磷的话，底物磷酸化怎么办？蛋白激酶把身价到底物上去？ |
|
d********y
发帖数: 6566 | 22 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: dragoncity (dragoncity), 信区: Military
标 题: 中国将可“无限生产 ”一种稀缺抗癌药
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Dec 10 10:08:44 2010, 美东)
我国科研人员在世界上首次找到一种可“无限制地生产”稀缺型抗癌特效药物——紫
杉醇的极佳途径，有望使癌症患者最终获得廉价、有效治疗药物成为可能。
黑龙江大学生命科学院教授周东坡说，他领导的一个研究小组经过8年的时间，已
经找到了一种利用生物工程的方法大规模生产紫杉醇的可行途径，解决了此药物获取源
严重匮乏的难题。据称，这条途径的发现在世界上尚属首次。
紫杉醇是红豆杉中特有的一种二萜类化合物，利用它作为主要成份，可以生产出世
界公认的可治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌等10多种癌症的特效药物。
然而，由于红豆杉已在全球处于濒临灭绝状态，其植株本身的紫杉醇含量又非常低
微，直接砍伐红豆杉、从其树皮和枝干中提取紫杉醇的途径已没有利用前途，使用化学
方法人工合成结构复杂的紫杉醇的途径目前也... 阅读全帖 |
|
g*********r
发帖数: 9366 | 23 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: dragoncity (dragoncity), 信区: Military
标 题: 中国将可“无限生产 ”一种稀缺抗癌药
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Dec 10 10:08:44 2010, 美东)
我国科研人员在世界上首次找到一种可“无限制地生产”稀缺型抗癌特效药物——紫
杉醇的极佳途径，有望使癌症患者最终获得廉价、有效治疗药物成为可能。
黑龙江大学生命科学院教授周东坡说，他领导的一个研究小组经过8年的时间，已
经找到了一种利用生物工程的方法大规模生产紫杉醇的可行途径，解决了此药物获取源
严重匮乏的难题。据称，这条途径的发现在世界上尚属首次。
紫杉醇是红豆杉中特有的一种二萜类化合物，利用它作为主要成份，可以生产出世
界公认的可治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌等10多种癌症的特效药物。
然而，由于红豆杉已在全球处于濒临灭绝状态，其植株本身的紫杉醇含量又非常低
微，直接砍伐红豆杉、从其树皮和枝干中提取紫杉醇的途径已没有利用前途，使用化学
方法人工合成结构复杂的紫杉醇的途径目前也... 阅读全帖 |
|
c*****o
发帖数: 18 | 24 细菌的细胞培养液有抗菌活性（可能是一种细菌素），过了0.22um syringe filter灭
菌后，没活性了？百思不得其解，请教各位大侠 原因？小生谢谢先 |
|
r***e
发帖数: 2539 | 25 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
加培养液和细胞。 |
|
o*****a
发帖数: 2335 | 26 大家都说不清，有的实验室说做能量源给细胞吃，有的说并不是必须。反正你给自己的
细胞保持一致就是了。medium里那东西在4°C下half-life也只有几个星期,所以有人喜
欢买不加L-Glu的培养液，每次要用之前再加 |
|
w*********n
发帖数: 439 | 27 多谢大虾
我们把心肌细胞消化出来以后放在体外培养,然后在培养液里面加入BrDU，发现有BrDu
阳性细胞
如果给小鼠注射BrdU，FACS发现只有心脏里面的杂细胞是Brdu阳性， 心肌细胞几乎没
有。 |
|
B********d
发帖数: 1893 | 28 我说了：“尽可能地和你要测的样品距离最近“。如果细胞培养的温度要求非常非常精
密，温度计悬在空气里自然是不合格的。你把温度计放在空气中，并以此当作细胞培养
液的温度，是有前提的：
（1）厂家设计的培养器（shaker) 使得细胞液和温度计放置位置的空气温度差别很小；
（2）你的实验不在乎细胞液和空气的温差；
我曾经用过的 Shaker 不需要我自己放温度计，是电子显示温度的，不清楚温度探针在
仪器的哪一个部位。我猜测这个设计应该使得示数和培养液的温度很接近，否则就是厂
家的设计失败。或者也可以提供用户自己校准温度指示的功能。
我想这是任何一个搞科研人员的基本素质。我是一个从物理科学转到生物领域的人，有
的时候觉得生物确实不太严密。 |
|
k****l
发帖数: 279 | 29 两个问题
1.看说明都是要放在-20度，可是sigma太俭朴了，直接室温寄过来了，会不会有稳定性
的问题？nadph会被空气氧化吗？
2.看到的文献大多是用它们做体外实验，有人加到细胞培养液当中吗？import 会不会
是问题？
多谢 |
|
b**********8
发帖数: 349 | 30 多谢楼上各位分享经验。看到有人建议用miniprep，可是我要用这个质粒做转染，
miniprep的产物可以直接转染吗？
另外，降低温度可能有效，这个温度有没有具体的范围呢？室温？30度？我昨天晚上又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把温度加到30度了，不知道行不行。 |
|
m*********7
发帖数: 606 | 31 为啥小提的产物不能直接做转染？你以为别人提１００个试管小提的产物是干嘛用的？
又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
温度加到30度了，不知道行不行。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 32 经典方法是直接摇1L，长到对数期的时候加点氯霉素抑制细胞分裂，
然后过夜。这样菌体可能和200ml的普通生长差不多，适合中大提，但
是质粒会累积很多
又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
温度加到30度了，不知道行不行。 |
|
|
m******5
发帖数: 1383 | 34 非常感谢!! 请问你们是用它来作chondrogenesis研究么？
在这个培养液里转染效率怎么样？如果用Fugene的话 |
|
r******j
发帖数: 780 | 35 每一个批评者挑一个方面批评：
批评者1：数据误差大，甚至超过背景
批评者2：砷磷化学性质差别大，怎么解释
批评者3：培养液里砷磷含量比和细胞内砷磷比差别太大，说明没进入dna
批评者4：提取dna的时候没有特别纯化
……………………………………………… |
|
|
b******3
发帖数: 377 | 37 用磷酸缓冲液会造成代谢物的leakage。但是不洗却会造成对代谢物分析的干扰。谢谢
！ |
|
|
b******3
发帖数: 377 | 39 那样还是会有污染啊，就是不想有培养基的信号出现。 |
|
h**********r
发帖数: 671 | 40 做个新鲜培养基的
control
或者
配个不会造成leakage的
buffer |
|
b******3
发帖数: 377 | 41 我就是检测所有代谢物的，所以任何外源无论是细胞外代谢物还是培养基都不希望看到
。所以就在找buffer. |
|
s********n
发帖数: 2939 | 42 一堆的buffer可以试，Tris, HEPES, etc. |
|
X*******0
发帖数: 134 | 43 某原核蛋白,在其原来的菌里的定位未知,蛋白序列本身找不到信号肽.
在大肠杆菌里表达.由于胞质表达总是包涵体,于是改周质表达.用的是pET26b,就是N端
加了一段pelB信号肽的.问题来了,表达完的蛋白去哪儿找?用哪部分纯化?是用细胞,还
是用培养基上清?问题等价于,蛋白(46kD)会不会大多数穿过细胞壁漏到培养液中.
做生化的,大量提蛋白解结构的,比较容易解答我的问题. |
|
m*****u
发帖数: 15526 | 44 分化的单核巨噬细胞，粒细胞很多是贴壁的。光吸出培养液根本收集不到这些细胞。96孔一个孔一个孔的彻底清洗，要累死。何况这样所有分化cell都mix在一起，镜子底下一个一个细胞形态辨别，计数。还得count 96孔的细胞，你自己想想有多少工作量。大的colony有几万个细胞也不稀奇.你说mutant集落形态会有变化不好认，不错，可是分散的单个细胞不是更难认？集落不好认，你可以挑出来做免疫染色或flowcytometry分析phenotype。一个一个分散的单个细胞你怎么分析phenotype？再怎么综合数据？
slide |
|
s******y
发帖数: 28562 | 45 嗯，有道理。那种即使是不喜欢贴壁的细胞，在半固体培养基上也可以固定在
一个具体位置上吧？
我还有一个好奇的问题是，你们做血液培养的人，万一需要换培养液的时候怎么避免把
细胞吸走？
我能不能再问问你们在那个半固体培养基上收集细胞的时候，需要加trypsin 么？
的细 |
|
m*****u
发帖数: 15526 | 46 半固体上是不换培养液的。细胞colony在半固体上固定在一个位置上。大的colony肉眼
可见，拿tip吸出来没什么问题 |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 47 这个很可能真实的结果是：
组别1：20%有效
组别2：非穴针扎， 10%有效
这个有效，有个体差异的。理论上，只要细分病人人群，最后能捞到一群病人，在这个
亚群里面有80-90%有效。当然，这个有效无效，有个细化的评价系统。这里不罗嗦了。
关于个体差异，我一直不注意，或许本来就不是医生。
我培养原代脐带血细胞，完全平行操作样品。大约10%的人，很难用我的培养液生长，
10%的特别能生长，其他在中间状态。
人与人在出生时，就有很大差异了，我完全可以想象，这些人日后体质，对药物反应肯
定不一样。
针灸发明时候恐怕是极小一群人身上弄出来的，大多数人应该是无感应的。
灸. |
|
b********h
发帖数: 348 | 48 有stemcell tech公司commercial的MSC培养液啊，养了多久之后退化的啊？ |
|
t******y
发帖数: 716 | 49 前段时间因为忙把细胞放在培养箱大约30天没去管，上周终于有空去看看了，10ml的培
养液已经剩下5ml左右，培养的3种细胞中，有2种居然显微镜下还有完整的细胞结构，
细胞比正常情况更扁平，表面有不少颗粒状囊泡，细胞虽然贴满了培养皿底，但是要比
正常情况稀疏。还有一种细胞是完全死光光，细胞碎片浮在上面。不想重新复苏细胞，
就把那2种细胞形态完好的换了培养液，过两天去看，居然细胞形态和正常情况差不多
，还看到分裂相的细胞。
大家还有谁碰到这么有耐力的细胞啊？ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 50 3D CULTURE 一般而言就是把细胞培养在一个泡在培养液的立体网络里，
而不是普通的平板里。最简单和普通的3D CULTURE就是把细胞养在用类似matrigel 这
种东西堆成的结构里。
3D CULTURE对于构造器官和组织结构的研究是一个非常关键的问题。对干细胞研究的直
接下游应用有关键意义。目前有非常多的未解决问题，比方说立体网络用什么材料构造
，如何保证养料和氧气的供应，等等。 |
|
