j*******8
发帖数: 933 | 1 沉淀前太稀了。 其实有人用不加秀芬兰的SB溶蛋白， 然后测浓度， 然后再泡脚。 不
过我不喜欢。 |
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x***o
发帖数: 47 | 2 我的一个蛋白有4个cys，下了ni柱就加了dtt，过分子筛时大部分在外水体积出来，在
单体位置
也有一点，但是不纯，外水体积出的一浓缩就沉淀，单体位置的没事，请问各位大侠有
什么好
办法消除多聚吗，还有沉淀是什么原因，谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 哦，这样的啊。
如果是培养的细胞的话，一般需要洗一洗来去掉培养基免得在分析样品的时候带进污染。
如果是在小虫里收集的胃。。。会不会有体液或者食物污染？如果有还是
要洗洗的。如果没有这个顾虑那就别洗了，听你讲起来好像样品很小的样子，
弄不好一洗就找不回来了。
如果裂解液里面的detergent过多，会干扰TCA沉淀的效果的。不过如果detergent
在１％以下还是可以用TCA的。TCA沉淀的时候蛋白都变性了，不会有phosphatase 作用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea or guanidinium 的话，phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)来抑制phosphatase.
如果用8M Urea，一般都是8M Urea in PBS, pH 大致调一下不要超过９就好了。
1 mg 组织? 这么少？一般而言20倍体积8M Urea就够了，所以20ul 就够了，
短暂的超声一下(15~30sec)，然后vortex 一分钟应该就好了，最后再加1/4 的 5X SDS... 阅读全帖 |
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s********x
发帖数: 472 | 4 你的detergent应该可以溶膜了，沉淀主要是细胞骨架。
看看你的蛋白是不是和骨架结合吧。
还有可能是过表达 折叠不好 根本不溶。
看看免疫荧光是不是有聚集。 |
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L****r
发帖数: 333 | 5 研究就是尝试不同的方法，从另外一个角度看问题，新方法容易发文章， 拿项目，
况且MALDI Imaging和LCMS各有千秋。
MALDI Imaging可以看到biomarker在组织里的真实分布，其萃取是利用溶解matrix的溶
剂（乙晴或者甲醇）在组织表面上直接进行的，找biomarker其实就是直接对比肿瘤和
健康组织的差异，如果在同一块板上同时扫描它们，结果很直接， 根据颜色深浅就能
判断。而LCMS的组织萃取，是用溶剂将蛋白沉淀，其实蛋白很难完全沉淀掉，然后真空
干燥除溶剂，然后做LCMS,biomarker特性有无变化，还真说不定。况且肿瘤和健康组织
分开处理， 分开进样， 容易引进误差， 比如样品处理，柱子性能的变化等。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 这几种方法你都可以试一下。没有哪一个是肯定保险的。
至于说用concentrator会损失蛋白？这个可能是因为你没有选对大小合适
的滤膜。一般来说，滤膜的孔的标定尺寸应该比你的蛋白的真正尺寸小
三倍。比方说30K 的蛋白必须用小于10K MWCO的膜，否则蛋白有可能漏过去。
另外，在dialysis 的时候，你可以在外面的溶液里也放上detergent 啊，
我不明白这个为什么会是问题。而且，一般来说，detergent 在溶液里
会形成微团，所以不会容易的透过滤膜
dialysis,
later
which |
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 请不要纠结蛋白B了可以么
就是我表达的蛋白B的结构也有了
SEC也是单峰
另外还有SAXS数据等等。。。。。。
现在要研究的是A
我们只知道A和B一定有相互作用
native species里in vivo有selfassembly的complex
不过种种原因没有办法从native source提纯研究
A直接做SEC显示是三聚体
不过别的实验数据倾向于应该不够compact的单体
A+B一混就沉淀，上清基本没有蛋白（BCA assay)
没有办法A+B过柱子
B。 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 8 如果楼主的博士论文就是这个，还可以继续
否则，我建议试验3个月，就投降，赶紧换下一个project
蛋白的东西，你折腾两年都不一定有结果，这里面的东西很烦的。
我3年前也搞过一个蛋白
我做了deletion，表达了30%，依旧很困难。样子和楼主描述的那个很像，
8M urea完全可以溶，然后一路降低到2M 就形成牛奶的乳白液，过夜就沉淀下来, self
-aagregation。始终很难获取solution
功能么，当然有很显著的功能，文献报告很明确。但就是搞不定
我仔细查了资料，想了半个月，我猜测，这种self-aggregation状态，和那种显著的功
能，恐怕有微妙的关系。
到这个份上，我就缴枪了，没时间耗得起。如果，我永远有钱有家产不在乎结果，我可
以花5年翻来覆去，所有现有办法都折腾一遍这个蛋白。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 9 ☆─────────────────────────────────────☆
giantbird05 (大鸟) 于 (Thu Jan 25 20:19:46 2007) 提到:
要裂解几十个T75 FLASK的细胞，然后用抗体把裂解液中的蛋白拉下来。。
裂解液的要几十毫升，我想浓缩一下，但是怕变性影响以后的免疫沉淀。
高手请进，帮我指导一下。
多谢了。
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pigskin (六如) 于 (Thu Jan 25 20:23:50 2007) 提到:
裂解液中的蛋白浓度已经很高了。。。
不好浓缩，而且容易把目标蛋白搞死。
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KingofMS (offer来了，H-1B没了。我苦) 于 (Thu Jan 25 20:24:05 2007) 提到:
columns packed with C4 (based on hydrophobicity)?
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s******y
发帖数: 28562 | 10 这个就是这样的，你要想漏过去的反而漏不过去。
不想要漏过去的反而会哗哗的漏掉。
而且，这种concentrator 设计的时候不是为了分离蛋白用的，
像你这种用法，会让很多蛋白会卡在孔里或者粘在膜上，不可能全部漏过去的，
能弄到20%已经不错了，但是如果你测一下上方溶液里的蛋白含量，应该会小于80% |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 动态光散射？ light scattering? 那个不适合用来检测那么小的蛋白的啊！
难道你们附近实验室都没有UV spectrometry?
另外，回答你刚才另外一个问题： 如果用G-150, 那么aggregate/polymer
会随着溶液直接往下走，也就是不进入resin 内部，所以会先出来。
单个蛋白会进入resin内部，所以会出来比较慢。
但是，在上柱子之前，最好先用0.2um nitrocellular membrane filter 过滤
一下样品，否则大块的沉淀会堵住resin.
另外，柱子很贵的！便宜的也得几百，贵的上千。
我建议你要是有可能的话，找别人帮你做。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 12 能不能用硫酸铵沉淀？
重做constructs显然要容易得多。
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的 |
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m******5
发帖数: 1383 | 13 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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s******3
发帖数: 28 | 14 蛋白本身不长，才50个不到aa，但是有8个cysteine!之前做表达用大肠融合表达，切了
之后就沉淀啦，估计是二硫键氧化后聚集啦，后来先在空气中把溶菌液搅拌加过氧化氢
氧化，再切，发现切不掉啦，没办法，老板让做真菌和植物，觉得不怎么靠谱呀，因为
蛋白本身就是抗真菌的。哪位前辈给点提示吧，这个做包涵体然后复性有戏吗？或者其
他什么比较高效点的表达系统？有人做过类似的东西么？谢谢呀 |
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V********n
发帖数: 305 | 15 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
１）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题，你都无从查找。
３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
，与多种因素相关。
４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
６）膜蛋白IP不好做。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 还是没明白你到底要做一个蛋白，还是两个蛋白
建议你先纯化到蛋白的复合物以后再浓缩
不要浓缩以后再把两个蛋白混起来
浓缩的话大体积可以用centricon
体积小的话用minicon |
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u**********d
发帖数: 573 | 17 我猜想你的意思是说一个TF的complex可能在DNA上才最终完成装配。不管怎样，之前大
家做IP都是用WCE或者NE，那么调查TF在chromatin上的相互作用蛋白至少是方法上有创
新的，而且原理上我认为也是很有意义的。
如果你的TF和DNA结合弱，那么最好cross-link一下，提取细胞核，破核膜（可以简单
超声或者过注射器针头），得到chromatin沉淀，这样里面残留的游离TF就很少了，然
后用MNase或者超声得到单个nucleosome或者很短的chromatin片段，然后IP。
这个方法的问题也是很大的，就是chromatin上面蛋白太多，要设置好的对照，确保找
到的相互作用蛋白是特异地由你的TF决定才出现在那里，而不是chromatin上的常规蛋
白。找到的candidate也很难进一步做相互作用的验证，in vitro chromatin assembly
这些实验没有一定的积累难以完成。
TF |
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z******i
发帖数: 120 | 18 看来楼主也是很费了一番功夫的。 俺也就很想能帮上忙。
1.你的A 蛋白是全长吗。不是的话，最好的办法就是加TAG. （最推荐的方法，目前你
还没有试过）
以俺经验，改变CONSTRUCT往往是最有效的。 试试改改。
2. BUFFER TEST 可以进一步做一下: 用CONCENTRATOR 把A.B 都浓缩一下，目的是要
FLOW THROUGH 的buffer。 然后用 A-B buffer ‘B－A BUFFER 再试试看。
3.PEI DNA/RNA， 然后硫酸铵沉淀蛋白，这样才能彻底去除 BOTH DNA/RNA 和 PEI。另
外你说的不知道结合不结合，可以看一下260/280 VALUE，很简单。不要用EB啥的，那
个不准，跟上样量有很大关系 |
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d****u
发帖数: 1553 | 19 这是一种可能，还有一种可能是你的蛋白和膜上的什么东东结合了才能保持构象稳定。
你把细胞裂解了可能导致了蛋白相互作用的破坏，间接破坏了蛋白的稳定性。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 20 不能在沉淀以前测浓度？
然后沉淀，用SB溶解。 |
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S*******l
发帖数: 4637 | 21 异体蛋白进入人体细胞是每时每刻都在发生的事情。
人一辈子就是在和外界不停交换物质。
疯牛病病原体是动物蛋白，因为进化同源，能引起人类内源蛋白沉淀。是非常罕见的情
况。 |
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j*******5
发帖数: 1252 | 22 最近发现自己嘴巴上方鼻子附近开始有小的纹路了，这可能就是传说中的法令纹，不知
道该怎么把它们给去除了。而且我还特别爱笑，说起话来感觉好像特别使劲，这种小纹
路时间久了恐怕就更明显了。
可是我眼睛周围还好，请问吃胶原蛋白有用吗？我自己不能做饭所以也没法吃什么猪蹄
猪脚补充胶原蛋白，只能吃药了。请问吃这个可行吗？
我平时不用眼霜，就用橄榄油来当眼霜了，不知道用的久了会不会有色素沉淀？
PS：我现在能理解小龙女为什么不会变老了，不悲不喜，没有特别大的情绪起伏，当然
能青春了！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 我也根据大家的讲话讲一下
如果某个codon 非常 rare,相对应的T-RNA太少的话，
使得某个蛋白翻译暂停的时间过久，一方面，会导致
频繁的翻译中断产生大量小片断--〉蛋白沉淀
另一方面，一般认为蛋白折叠的时候，是由local regime
先折叠，然后再总体把折叠好的local structure加起来调整
调整的。在这种情况下，timing, 和折叠顺序，对最终结构
是有影响的。 |
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k********u
发帖数: 2209 | 24 NaCl在纯化过程中主要的作用是维持离子强度，离子强度太低了，有些蛋白
会沉淀的。是做膜蛋白吗？如果是的话，还可以试试看cobalt的柱子，
和Ni差不多的东西，很多做功能的人更喜欢cobalt。 |
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m********r
发帖数: 124 | 25 1.老板也说了，但是暗示对现有project意义不大，因为我们就需要的大量的蛋白做个
相互作用的HSQC，所以暂时不主张做
2,我已经18度了，不能再低了吧
3.这个我倒听说过，防止蛋白聚集沉淀吧，可以在Ni柱的buffer里加码？ |
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p****p
发帖数: 3360 | 26 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。 |
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p*********n
发帖数: 556 | 27 人家问前途，瞧这楼歪到纯技术去了。
我的phd thesis就是做dynamics。我有同实验室的用NMR解结构，还不是什么很大的蛋
白，就痛苦的不行了。所以我觉得protein NMR适合跟人搞合作，有特定的问题用NMR的
方法很有用。另外一个不能忽视的问题就是要把蛋白表达到比较高的浓度，又不沉淀也
不是那么容易的。很多人3，4年都用在表达蛋白上，剩下1，2年真正做NMR实验。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 28 如果直接把纯化好的蛋白A和B加在一起
立刻沉淀了
摩尔比例试过从1：64到16：1
所以尝试共表达
希望能够得到一些可溶的复合物 |
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e**e
发帖数: 166 | 29 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概４００－５００Dka。
我用NP４０ 溶解后，用６０％的（NH４）２SO４沉淀可以得到６０％的活性。 现在
过分子筛柱。
我有个（LKB Triacryl GF２００）的柱子 （１。６ x ６０cm） （１２０，０００－
１５，０００，０００）。 我用Hepes buffer （１ml／min的流速。 我在用Blue
Dextran （MW ２，０００，０００）和BSA 的时候， 发现他们同时一起出来了。
这个柱子可以分离吗？ 还有别的建议吗？ |
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x********e
发帖数: 35261 | 30 有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的target
。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋白/
DNA之间有无关联。 |
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w*****8
发帖数: 193 | 31 我最近用TEV protease cleave我的蛋白中的TEV site，好几次都害得蛋白全部沉淀出
来。有没有人有相同的经验啊？难道是TEV加的太多了吗？我是1：20的加TEV |
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s*******w
发帖数: 1879 | 32 你vortex的速度多少？你第一次离心取沉积的时候会不会细胞已经裂解了？
还有你煮95度15分钟看到什么变化没有？沉淀有么？会不会你要的蛋白全部变性聚集了
压根跑不进胶里去（我干过一次这事）。。。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 34 这个sds碰上钾离子沉淀是碱法抽质粒的基础之一 |
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K**********e
发帖数: 188 | 35 ？？为什么不可能？
就是含有氯化钾的buffer，遇到loading buffer里面的SDS，生成SDS钾，就沉淀了。
会不会影响跑胶？ |
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K**********e
发帖数: 188 | 36 用丙酮沉淀，会不会把盐也搞下来呢？
会损失多少？ |
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o*****4
发帖数: 1245 | 37 1。有可能A降解了，有可能沉淀了（嗯，sds解不了所有的沉淀）。2.biological
repeat不出来很正常，多repeat几次看个SEM |
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s*******t
发帖数: 7746 | 38 没买个Ricotta cheese，但google了一下，这种cheese是用做一般cheese 蛋白沉淀后的水（只含少量的蛋白）做的，营养可能没有一般的cheese 好。
pampers。com上的建议
http://www.pampers.com/en_US/parenting-articles/feeding-your-to
1 Year
String cheese or small cubes of cheese are a good way to give your child
calcium if he doesn't like milk or even if he does. Cottage cheese is also a
favorite; again, be ready for a mess!
18 month old
String cheese, slices of American cheese, cubes of cheddar — whatever works
. If you find a cheese your toddler likes, let hi... 阅读全帖 |
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v*********i
发帖数: 40 | 39 这是不是意味着，我看到沉淀那一步，细胞质和核内的蛋白都已经溶解到上清里面了；
并不需要再超声，对吗? |
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a****o
发帖数: 1786 | 40 如果已经是纯化的蛋白，就不用硫酸铵了吧，这个主要是分离用的
可以用乙醇或TCA， 不知道会不会好溶，没经验 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 小师弟呵，那个三倍的说法是蛋白生化界人常用的。
因为公司们标定那个MWCO 一般是用直链高分子聚合物来测的。
换算成球型分子就必须比这个大三倍，才能保证球形分子的直径是孔径的
1。5倍左右 |
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a***a
发帖数: 40617 | 42 漏也漏不了多少，我用30k的concentrator试着想分离10k的蛋白（可以想让他
漏过去）
结果发现也就20%能过去。。。 |
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m****m
发帖数: 395 | 43 难道就没有一个既好用又省事的浓缩蛋白的方法吗？可以真空抽吗，弄掉些水分就好阿 |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 当然可以，真空抽，保持比较低的温度（10度左右就好）
但是，抽完之后溶液里的盐度会很高的，得dialyze 一次。
或者，你一开始就用比较低盐的溶液的溶解蛋白，然后再抽真空。 |
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m****m
发帖数: 395 | 46 我想把磷脂蛋白抽干些可以放多点样品到ROTOR里，老板还不同意呢，说水分的多少可
能会影响结构功能。。。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 47 你说的就是冷冻干燥啊，冷冻干燥也有保持蛋白活性和保持活性的问题。而且往往要加
入大量的保护剂，BSA之类的。
研究上还是超滤好。而且Sunnyday说的膜孔3倍分子量以下是很对的。 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 49 没错， 很多 微晶大家容易混同成 light grainy precipitation, 而且反正也衍射不
好，所以也就不去看了， 基本上都要看最少能分清是不是沉淀的才去优化
这一步就丢掉了很多机会。 但是这个screening 的时间和成本？
说一句题外话， 到底有多少蛋白无论如何不结晶呢？ |
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K**********e
发帖数: 188 | 50 那用KCl溶液溶解的蛋白怎么跑胶呢？
我必须用KCl做buffer的盐 |
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