T**********t
发帖数: 1604 | 1 我需要的是测量实验条件下的蛋白浓度，所以我一般是上样之后，用剩下的样品测浓度
，所以样品体积很小。另外我也担心如果把sample送出去，在运输或者对方的实验室保
存的时候样品浓度发生变化或者样品沉淀了降解了什么的。
我也同意做梯度稀释测浓度曲线应该更准，可是我担心样品不够，起始浓度就不高了，
体积还小，估计上样之后的leftover也就几十微升吧，OD280在0.3-0.4左右。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 2 你可以试试加SDS溶解，但具体的浓度你得参照你的蛋白测定方法所能忍受的SDS浓度范
围。 |
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m**z
发帖数: 787 | 3 那么高倒是没有听说过... 蛋白的话那么高温度能稳定不沉淀嘛。。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 4 如果我是你，先检查下面2个问题再考虑Protease的问题。Protease也不会切得干干净
净，你应该在胶上看到略小的带才是。
1.tag有没有切下来？
Ni-column用咪唑洗一下，跑跑看柱子上挂的是不是只有小tag.
2.没Tag了，蛋白是不是沉淀了？
酶切前后的样品高速离心一下，上清和pellet都测一下。
70aa |
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a******g
发帖数: 71 | 5 第一步从包涵体中纯化是用Ni柱，第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素
且确保不沉淀，然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对，然后有一个再纯化的
过程去除没有复性而聚集的蛋白，这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC，走gel
filtration，结果都非常好。
在实验室里，罗从来不会公布复性的方法，因为这个是商业机密，没有哪个学生知道。 |
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V********n
发帖数: 305 | 6 仅供参考。
可能出的状况
1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
件可能不能太极端，需要摸条件。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 7 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗？
如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近，
你先试试不用cross-link做IP好了……
你elution volume是多少？都跑胶了吗？
如果volume大可以concentrate一下，全跑
这个KIT你可以自己order各个试剂，elution buffer也可以找到recipe啊
另外，顶楼上，膜蛋白不好做，搜一搜别人的paper，看用的是什么条件
IP的抗体也要多试几个……
300-400ug有点少啊，多弄点sample啊 |
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F******S
发帖数: 13 | 8 请问你用来resuspend pellet的native lysis buffer是怎么配的， QIAGEN的PROTOCOL
里面有0.3M NaCl， 你再加1% SDS 岂不是全都是沉淀。
assay, |
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c********b
发帖数: 363 | 9 我是先resuspend之后再加的SDS，冰上放着没有看到沉淀。
PROTOCOL |
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y********g
发帖数: 782 | 10 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
大家有protocol可以share一下吗？
我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
很崩溃~~
求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~ |
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s********n
发帖数: 2939 | 11 Blue Native gel可行否？
如果你试了低浓度混合没有发现明显沉淀的话，你可以进一步用ultrafiltration浓缩
一下，但具体能浓缩到什么程度就不知道了，你得trial and error一番。
A和B是用同一种purification tag吗？如果不同的话，你可以试试在混合后纯化那个比
例少的，假如AB complex比较稳定的话。
DLS也需要一定浓度才能准确，如果浓度太低可能不一定准确。 |
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n*q
发帖数: 258 | 14 谢谢大家帮忙。
今天试了一下，用CH3CN沉淀，再离心，把上清液弄出来LCMS显示没有蛋白了。里面的
另外一个有机物还在。明天要试一下，加入内标，看LCMS的recovery如何。
还有另外一个项目，也跟这类似，里面有多肽。希望不要做固相萃取(SPE)，那个比较
麻烦。 |
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g***s
发帖数: 30 | 15 你的意思是我的蛋白因为和膜组分结合，所以分离不出来？ |
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g***s
发帖数: 30 | 16 那对于细胞骨架蛋白的IP实验，有什么特别的要点吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 最大的可能是沉淀了，
除非你在冷冻之前用液氮迅速把蛋白溶液冻起来，否则放在冰箱里慢慢的冷就会导致蛋
白溶液局部过浓而产生互相纠缠，然后就附在管壁弄不下来了。这个作用对于大分子最
明显。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 18 Ip 蛋白下来做结构？质谱？怎么保证ip后，蛋白不发生大的构象变化？
如果我理解对的话，
这个构象的不同最好应该是用purified protein做。在体外重构所谓的不同条件。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 19 当然的有control啊，或者pre-clear,或者搞个competition什么的
：有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的
target
：。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋
白/DNA之间有无关联。 |
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g*****x
发帖数: 3283 | 20 当然要提蛋白了啊，这个用MWCO浓缩一下TCA沉淀就搞定了 |
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h**********8
发帖数: 28 | 21 SDS-PAGE Loading buffer直接煮，应该问题不大。
这个loading buffer里面含有SDS和DTT(或者B-MERCAPTETHANOL)还原剂，可以打破双硫
健以及分子之间的吸引力。
一般LOADING BUFFER煮5-10分钟，蛋白完全变性，就ok了。
如果煮了之后，还不行的话，用超声波再打一打，然后再煮。 |
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r****o
发帖数: 105 | 22 低盐浓度下，离子与蛋白质分子带电基团相互作用，可以稳定蛋白质。
这种情况下增加盐浓度有利于增加蛋白质的溶解。但是盐浓度高到一定程度时
候，会与蛋白质分子争夺水分子，使得蛋白质在缺少溶剂水的情况下发生
聚集和沉淀。前一个现象叫salt in,后一个现象叫salt out. |
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q******g
发帖数: 3858 | 23 RIPA buffer是比较强的裂解液，容易使细胞核裂解，染色体DNA出来。超声后，DNA断
裂，就看不到那些沉淀了。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 24 SCIENCE 2008 320(5882): 1496-1501
YASEMIN SANCAK et al.
The rag gtpases bind raptor and .....
浓度，时间（高了会使蛋白沉淀很多， 而且假阳性）要优化， 多抗比一抗好。
crosslinking很可能会大大降低单抗的亲和力 |
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t********y
发帖数: 6 | 25 当然也在4度下.
看文章多数是抗体+细胞裂解液两样摇过夜,第二天再上珠子,可我这样做拉不下蛋白.
如果三样同摇,条带倒有了,又怕是非特异.卖我抗体的说他们就这么做(摇三样过夜)没
问题,IgG也不会有条带,结果我这么做IgG对照又有条带!(不过我这个IgG质量也有些可
疑)
其他方法也在试,如果加大IP抗体的量吧,似乎珠子就有些凝聚成坨,似乎也加大非特异
的风险.
有没有人有经验指点一下,这么做行么?谢谢了 |
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f********n
发帖数: 6465 | 26 不是死细胞碎片，就是FBS的蛋白沉淀．
不要紧． |
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g*****y
发帖数: 6325 | 27 是啊，是ecoli细胞分泌到溶液里的，你加amp都很快降解，所以必须沉淀细胞加新溶液
。 一半用amp的vector induce ,我
都不会培养超过12小时. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 29 这种情况我建议查文献，看到底是那个氨基酸影响融解性，在不影响结构的情况下 做
个该位点的mutation来增强蛋白溶解性。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 说的再具体点？
用3k或10k MWCO的centricon/minicon么？
上样是什么？裂解、蛋白沉淀以后的上清？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底，方法不够好。
但是，如果透析法导致大量蛋白沉淀的话，就是更糟糕的情况。
gel
10 |
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s******y
发帖数: 28562 | 35 你也许可以试着transient crosslink,
然后免疫共沉淀， 分析出来的东西再挑几个出来用免疫荧光来重复肯定一下 |
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Z******5
发帖数: 435 | 36 看是不是在inclusion body里很简单啊，收菌洗两遍后，超声破碎，然后离心，上清和
沉淀分别用loading buffer溶解，泡脚。 |
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a******g
发帖数: 71 | 37 endostatin不是简单地一步Ni柱纯化，据我了解，应该是首先破菌，分离包涵体，充分
洗涤包涵体（洗涤过后纯度就达到90%），然后8M urea溶解，过Ni柱，然后有一步最关
键的refolding，也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond，在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后，50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在，其他不能refold的则聚集形成胶体，经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%，银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 38 18个cysteine，估计有不少的disulfide bonds，你是表达在E. coli的cytoplasm？如
果是的话，misfold的可能性很大。GST增加了fusion的可溶性，切掉以后就沉淀了。 |
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k****o
发帖数: 589 | 39
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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k****o
发帖数: 589 | 40
用DSS一是不想看到IgG的带，还有就是当初想重复用agarose beads，因为IP需要的抗
体量太大了，想省钱。
洗脱体积是190 ul，IP前的total protein加了350 ug，洗脱后用了36 ul跑胶。
用那么多蛋白做IP实属无奈，我用的是原代细胞，只有那么多量。
请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧，可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。 |
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y********g
发帖数: 782 | 42 全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
景太高。 我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
大家beads是怎么clear的？
我看protocol 通常有3种
1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
Beads+抗体+样品液 混在一起4度过夜。
3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了 |
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k****o
发帖数: 589 | 44 发现加了sample buffer变性冷冻再解冻后，有时会出现透明胶状沉淀。这样对结果会
不会有影响？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 如果你不关心蛋白是否变性的话可以用8M urea，而且也不影响跑胶。
6M Guanidine 更好使，就是用完之后不太好跑胶。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 47 1％SDS都无法溶解，这蛋白质有点生猛，是输水的膜蛋白吗？
有没有加了还原剂？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 48 好像在23KD那过了Ni-NTA柱也有一个条带，比较淡而已
ion exchange之后是不是只是enrich了这个non-specific band
如果可能搜集过ion-exchange的flow through跑一下SDS-PAGE
另外一种可能是蛋白沉淀之后trap在柱子里面了
ion |
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a********g
发帖数: 558 | 49 我很同意你的观点，就是切掉GST 就不稳定了，当我浓缩的时候还会沉淀，不切GST的
时候可以浓缩的非常浓也没问题。
我是用的pGEX-６P-１plasmid， in column digestion 用的Precission protease，从
GE healthcare买的。
如果直接Elution GST fusion protein的话，确实有杂带。
那我怎么才能把molecular chaperone去掉呢？本人医学背景对这方面不太在行，多谢
指教。 |
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