z****z
发帖数: 42 | 1 一般用RIPA
你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
Good luck. |
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a****k
发帖数: 1130 | 2 偶来补充自己的看法吧：透析不是必须的，只要imidazole不影响activity就好。一般
不用再加protease inhibitor，因为细胞裂解的时候不是已经加过了吗。不建议加EDTA
，不知道lz是要做什么activity assay，很有可能这个蛋白本身自己就是需要镁离子的。
glycerol，对于一般的蛋白我们都是加10%，然后分装后用液氮冻完存在－80度。但是
碰到很不好保存的蛋白，比如冻了一两个月就没有activity的，把glycerol加到20％会
有帮助。
DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白 |
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y**y
发帖数: 36 | 3 自己没做过 实验室同事做过 她是直接合成的50b左右，biotin标记， 和核裂解液incu
bate, pull down, WB, ....
2 300合成太长了吧， 你对该蛋白的结合信息应该有一点吧 包含该位置有可以了啊
good luck |
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w*****g
发帖数: 20 | 4 想用promege 公司的passive lysis buffer 裂解细胞，做完luc assay,然后用lysate
做western-blotting.
谁有经验，请指点。 |
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s**x
发帖数: 138 | 5 我曾经做过这个。macrophage很大，小的是红细胞。所以，你再打开腹膜腔的时候，
注意不要损伤到血管。而且，macro是贴壁的。红细胞不贴壁。你可以多用PBS洗几次。
据说，用水短时间洗一下(after 贴壁)， 红细胞会很快裂解。而macro不会。 |
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m****m
发帖数: 395 | 6 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
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p*****r
发帖数: 64 | 7 多谢大家的建议.
aishang,我目前就想用机器先remove大部分的medium,剩下约8ul的medium (如果剩下的
medium太少的话,机器的tip头就会很容易带走细胞),然后多加一些lysis buffer.虽然
这样lysis buffer被稀释了,但可以试试能不能拿到足够的RNA.
ArtyArty: 我目前用的是Cell to CT kit, 它提供lysis buffer, stop buffer,裂解细
胞后,可以拿到RNA, 然后RT 后拿到cDNA.你能不能告诉我你知道的那个不用提RNA,就可
以做qPCR 的kit吗?十分感谢
smartkevin: 多谢你帮我查的plate, 我先打电话问问corning,看他们的这个plate怎么
work的,希望fit my story
目前这个实验是在broad做的,但broad里的人都用贴壁细胞,这样remove medium的时候,
细胞都不会少,所以他们对我的悬浮细胞也没什么好的建议.
多谢各位了. |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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x********a
发帖数: 157 | 9 我的裂解液成分是：
50 mM Tris-HCl (Ph 7.4)
150 mM NaCl
2 mM EDTA
5% glycerol
1% Triton
然后每1毫升上述的液体加 10 ul 0.1M PMSF 和 20 ul Protein inhibitor cocktail. |
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f******k
发帖数: 856 | 10 triton裂解完的溶液就是很浓稠，我不建议用，建议你换NP40，或者IGAPAL
cocktail. |
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m*****l
发帖数: 28 | 11 给你个trick， 解决裂解后lysate太粘的问题。
用sonication， 低点的level稍微打一下 |
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m******5
发帖数: 1383 | 12 确实是这样……其实即使是用常规裂解方法在显微镜下看也还是有很多核是完整的
这个相互作用又太脆了我连超声都不敢用…… |
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f**u
发帖数: 346 | 13 我也很喜欢那个化学家，看上去像是真正的学者。
对于那个第一作者，我觉得学术界的人恐怕对她会有看法，
但不可否认她的表演也许对公众和那些议员真的挺有用的。
至于你说的同位素标记，我可没你那么乐观，如果你去看看她的method，可能会有同感。
她纯化DNA的方法是细胞pellet裂解之后用酚氯仿多次抽提，然后水项用乙醇沉淀。
得到的DNA pellet都没说用70%酒精洗一遍就用buffer溶解了，然后溶液直接测放射性。
就算用70%酒精洗了一遍，最后得到的DNA里面也会有微量的盐污染。
我没有定量算过他们加到培养基里的放射强度和最后测到的放射强度间的关系，
有兴趣的朋友们可以自己算算。
最大的问题是她们没有阴性对照，不知道背景会有多大。
P |
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b****r
发帖数: 17995 | 14 我怎么记得血清里充满了各种来源的DNA RNA ，可不光是血细胞来源的。组织里的细胞
裂解后释放的DNA RNA都能很轻易地进入血浆吧，又分子量小又易溶的东西
起码gDNA是这样的，比如怀孕期间母血里会有不少胎儿的DNA |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 啊。。。我不是在国内上的研究生，所以一下子没有认出你说的蛋氨酸是什么。。。
我还以为你是泛指蛋白质和氨基酸呢。呵呵呵 |
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s********n
发帖数: 2939 | 16 如果还是不行，你可以试试这个protocol:
1. 挑一个colony加到5 ul solution 2 （plasmids prep）；
2. pipette几次确保细胞裂解了(可以加热到100C for 2 min)；
3. 加入0.5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) or H2O;
4. 15,000xg for 5 min;
5. 用上清作为模板(0.5 or 1 ul)；
6. 这个上清可以保存在-20C供下次再用。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 17 你不如用1x的buffer直接去裂解组织/细胞。加样的时候，孔有多大就多大量sample。
如果嫌蛋白还不够多，就减少buffer用量，以增加蛋白浓度。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 18 多谢！有时候裂解细胞跑蛋白胶的话，我们是直接用5Xsample buffer的。但是有的时
候，比如Co-IP的样品，浓度不高，就得考虑体积因素了。^_^ |
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p****z
发帖数: 31 | 19 最近直接用1*SDS sample buffer溶解细胞，煮10分钟，13K rpm离心后，在液体表面老
是会有一层白色的不溶物，试过用超声破碎，没效果，打散之后，重新离心还是那样。
换过SDS sample buffer也还是会这样。试图吸出来，一弄就散，然后和溶液混在一起
。细胞在加裂解液之前都有用 PBS洗过。如果样品就这样加进去，会导致vertical
streaking，有时候50kD 以下的lane会连在一起。有人知道这是什么状况吗？或者有可
能是哪些问题？谢谢赐教！ |
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m********r
发帖数: 124 | 20 Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了，250或者 500的盐都是，我都不好意思上我的胶图
了，我的融合蛋白量（25KD）在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白，但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子，主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的；
GST 我有另一个麻烦，就是free GST很多，摇再多的菌，也有一半以上的GST 结合到
beads上，fusion protein相对结合的少啊，这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换，我还没试。但我想尝试上来就用它，而不是Ni之后。我们没有mono的
，都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊，我在国内的时候
试过，不是很好用。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 21 细胞裂解的时候有没有加protease inhibitor cocktail? |
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B******o
发帖数: 496 | 22 它家的柱子比qiagen好像厚些，bind的DNA多些。至于滴的速度，跟你的裂解液是不是
离心彻底很有关系吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 23 affimetrix好像现在是4－plex，用不同颜色
那个啥公司来着，我忘了名字了，N-plex的，用不用的barcode，不过要裂解细胞先 |
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K**********e
发帖数: 188 | 24 想用来亲和纯化细胞裂解液里面的Flag tag的蛋白。用了sigma公司的ANTI-FLAG M2
Affinity Gel。
请问
1 这种beads使用前想离心wash，很难离心下去，因为很细小。一般每次用多少转速多
久？我用了500 g，怕转速高了把
beads弄坏了。
2 100 ul beads最多能结合多少毫克蛋白？
这两个问题sigma的datasheet上都没说（或者我没找到）。
盼望能有人指点下。谢谢！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 http://www.chinacdc.cn/n272442/n272530/n273736/n273947/n320831/
1．正在应用的流感疫苗
流感病毒灭活疫苗是目前注册的唯一人用流感疫亩，目前用于免疫人群的疫苗主要
是针对甲型流感病毒H1N1亚型。H3N3亚型以及乙型流感病毒的三联灭活疫苗。包括括以
下几种。
l．l 流感全病毒灭活疫苗：
1.2裂解型流感灭活疫苗：
l.3亚单位型流感灭活疫苗：
2．研制中的流感疫苗
2．l 减毒活疫苗：
2.2基因工程疫苗：
2.2.1 基因工程活疫苗：
2.2.2 基因工程亚单位疫苗：
2．3核酸疫苗：
2．4 通用疫苗：
3．其它
3.1 反基因工程疫苗：
3.2 佐剂疫苗：
3.3 微毒粒疫苗（virosome）： |
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w**t
发帖数: 52 | 26 你的polysome好少喔，我之前的结果应该是和80S差不多的，而且40S 和 60S也挺高的。
我试过手工分组分，但是是100ul一个，效果不好。后来找了台bio-rad biologic LP，
接UV detecter 连续检测出来的图就好看一点了。
然后裂解的时候也要加CHX喔 |
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y********g
发帖数: 782 | 27 1、每个reaction大概需要多少细胞。
2、sonication时，当时tube中裂解液的体积是不是很重要，大约多少ul比较好？
3、用液氮闪冻一下，是不是必须的？
4、PMSF要不要加？磷酸化酶抑制剂要加么？
5、用磁珠的话，也要preclear么？
十分感谢！！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 以前好好的。接着几次跑胶小片段都有点弥散，不知道原因。左图是筛克隆时的双酶切
，质粒是按《分子克隆》的碱裂解法提的。右图借用别的lab的qiagen的试剂盒提的然
后双酶切。问题也可能出在loading dye上。按《分子克隆》配的6X,40% sucrose加上
两种染料。EB是直接加在胶里的。大家看看吧，多谢！ |
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Z******5
发帖数: 435 | 30 把菌液离心沉淀，加1/10~1/20的裂解缓冲液重悬，再加相应体积的5xloading buffer
，100度煮5分钟，12000转离心2分钟，搞定，取上清直接上样就行了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 不要加甘油，用液氮直接冷冻，然后再放冰箱。
直接37度解冻
加那么高浓度的甘油的话会改变膜蛋白构象 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 32 15-20%的甘油即可，50%太夸张了
膜蛋白其实对冻融过程抵抗能力更强一些，但是我不太同意37度解冻，不知多少蛋白酶
会happy的不得了，我一般自来水冲
其实最好先低（1kG，取上清）后高（>50kG，取沉淀）把膜提出来再冻，干净得多 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 说的再具体点？
用3k或10k MWCO的centricon/minicon么？
上样是什么？裂解、蛋白沉淀以后的上清？ |
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s******n
发帖数: 63 | 34 最近在做内源性的IP，用rabbit来源的抗体IP蛋白X，然后IB可能与X有相互作用的蛋白
Y，IB蛋白Y用的抗体是兔来源的，设置了rabbit IgG对照，并且收蛋白前加了几种处理
，假定是条件A、条件B、以及untreated, IB后曝光发现，条件B的样品在55kD处检测
到条带，A和Untreated以及IgG对照都没有，条带不像是重链那种黑乎乎的感觉，但是
分子量不太符合Y，在各种条件WB蛋白Y时它都出现在接近72kD处（这个是很确定的，因
为有缺陷小鼠和稳筛的细胞做对照）。做了两次都这样，IP的蛋白裂解液总蛋白量是一
致的，加的beads、抗体的量应该也没有差错。请问版上的同学们，检测的条带究竟是
重链呢，还是我的目的条带呢？如果是重链，好像应该A、B、Untreated、IgG无差异啊
，但是为什么分子量会和WB时不一样呢？要是比WB时的分子量大也就算了，居然还比WB
时小，真崩溃啊........ |
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T**********r
发帖数: 287 | 35 从组织里分离细胞，之后FACS，直接sort到RLT裂解液里（from Qiagen RNeasy plus
mini kit),
获得cell 数量约20000，之后用RNeasy kit提取RNA，获得的RNA送去gene-profiling,
总是说质量
不好。
求有经验的同学给些建议，感激不尽。 |
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t*******n
发帖数: 446 | 36 多谢回复！我的培养产物先是变得很澄清像你的第一张图，摇过夜后又长回来，像你的
第二张图。倒是没什么泡沫，闻上去像酵母，不过酵母应该不会杀细菌吧？有一次我把
同一瓶LB种子培养基扩增的菌体离心后分到两瓶M9中，结果一瓶正常，一瓶出状况。所
以我不确定是不是是培养箱的问题。我今天看了一篇文章讲可以放缓细菌生长的速度来
抑制噬菌体引起的细菌裂解，文章是建议用20度来扩增细菌，不知道有没有人这样试过
，大概从0.1括增到1.0需要多久？ |
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b*******s
发帖数: 954 | 37 做蛋白出身，实验室有昂贵过蛋白柱子的大侠就不用往下看了。
我半路出家，做了五六年蛋白纯化，走无数弯路。在的实验室也没有特别做蛋白的经验，什么fancy的分蛋白的东东都没有。现在有一点点心得，希望我的经验可以帮楼主少走些弯路。
我的蛋白最早也是在包涵体里，我折腾Urea, 变性复性，整了两年，也没有拿到什么好用的蛋白。
(1)如果楼主需要用蛋白做functional experiment的话，可以试试不用变性复性的办法。降低表达的温度。室温下过夜都可以。如果有条件的话，试试14度。
这样蛋白更有可能是可溶性的。
摸条件时，可以做3ml 的小样，看看在什么样的温度和时间下表达量最高。然后放大表达。
（2）在(1)的低温条件下，多表达一些菌，
我现在实验室条件不好，我每天摇几百毫升菌。离心后冻在-80度。收集到五升以后，在同一天破细菌收蛋白。然后24小时之内连续做实验把蛋白拿到。
(3) 过柱子时不要贪快，让裂解的菌液缓缓流下。
你的蛋白出现在elution 之前的组分里，我猜就是没有挂住。
(4) 洗脱时可以快速，如果你用的是一般的小柱子的话。可以在柱子下面加一根长管子。
good luc... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 38 没做过
但是个人感觉原理上可行
肥皂是detergent，加水溶解处理应该可以破细胞
从而释放出DNA（加热煮沸能促进细胞裂解）
如果能离心，取上清加入3倍体积酒精晃晃应该就能取出DNA了 |
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m****M
发帖数: 360 | 39 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 40 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads |
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Z******5
发帖数: 435 | 41 不过你的既然能测到活性，应该还是有可溶的。 很有可能是可溶的部分量很少，要不
你把裂解液上清泡脚后做银染看看。
还有一种可能，看你的描述，难道另一个蛋白是分泌到培养基中了？ |
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b********c
发帖数: 161 | 42 多谢大家的分析,我终于找到原因了,我前2次做sonication做的不充分,结果细胞根本没
有完全裂解,今天重新做了次,就看到了可溶部分的蛋白了,但还是有一部分在pellet里
面.不过可溶部分的就够我用了.
真是太坑大家了,实在对不起. |
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d****i
发帖数: 2346 | 43 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
pyrsequencing检测甲基化程度。
问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
谢谢！ |
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W*********n
发帖数: 775 | 44 非常感谢！
染。
用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea or guanidinium 的话，
phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)
来抑制phosphatase.
SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel. |
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W*********n
发帖数: 775 | 45 please help me to have a look at the whole protocols and give some
suggesitons:
1) get 50midguts (about 3000cells/midgut, so about 1,500,000 cells or 80ug
protein totally),add 80ul lysis buffer (8M Urea, in 1XPBS, pH=8) including
Protease inhibitor and phosphatase, ultrasonic for 15-30 sec, then votex for
1 min. centrifuge for 10min at 14,000g and take the supernatant, add 16ul
5X loading buffer and heat for 20--30 min at 60 degree. load gel at 30ul/
lane and run for 2cm(for each sample, run th... 阅读全帖 |
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b***g
发帖数: 516 | 46 以前有过，我觉得是和DNA的质量有关。我原来提tailDNA的时候只用酸碱裂解，这样的
DNA非常不纯，所有有的有，有的没有。后来用了proteinaseK，效率提高了点，异丙醇
沉淀一下更好，用kit纯的完全没问题。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 47 我仔细研究过碱裂解的DNA做genotyping的问题, 觉得要尽量少加DNA, 否则PCR里面盐
浓度不对. 除此之外这个方法太好了, 非常快. 我用这个方法做genotyping, 基本上
没有pcr不成的情况. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 48 可以合成这段DNA,生物素标记，然后裂解细胞核，mix overnight
然后 Streptavidin Magnetic Beads
这样标记的DNA被拉下来。复合体也被拉下来
设计好对照。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 49 摇20小时有可能太久了，如果菌长太密了，养分和氧气耗尽的话，菌体自身含有的溶原
性噬菌体可能会进入裂解周期，这样就会出现类似噬菌体感染的菌液变清，菌量减少的
情况。你把摇菌时间减半试试。或者降低摇菌温度，这样细菌长得慢。 |
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z*t
发帖数: 863 | 50 屠的“青蒿”提取物在临床试验差点因为心脏毒性被毙,黄花蒿（中医正品讲的臭蒿）
其实救了这个药，山东和云南的大夫还有植物学家们有他们的功劳。
（这个问题造成了后来山东和云南对屠首功的异议，认为她没有正确辨认植物，正品青
蒿实际没有抗疟作用。预实验的成功可能是正品青蒿掺入黄花蒿的后的结果）。还有悲
剧的中药常山，是中医最常用的抗疟药，但因为毒性一直无法使用。。。
Lasker奖颁给屠是对她贡献的肯定，不过更多在她Lasker光环背后的人的故事一样精彩
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原帖地址
http://www.cchere.com/article/2064202
http://www.cchere.com/article/2064221
由带疟原虫的蚊子传播的疟疾是世界上最严重的传染病之一，直到今天全球仍有20亿人
生活在疟疾高发地区——非洲，东南亚，南亚和南美。每年大约有2亿人被感染，100多
万人因此丧命，主要是孕妇和5岁以下儿童。目前治疗疟疾的最有效的药物之一就是中
国在七十年代研制的青蒿素，这也是建国后中国医药界最重要的成果。
青蒿素的研究发端于六十年代越南战争... 阅读全帖 |
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