k****o
发帖数: 589 | 1
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
|
V********n
发帖数: 305 | 2 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
１）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题，你都无从查找。
３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
，与多种因素相关。
４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
６）膜蛋白IP不好做。 |
|
k****o
发帖数: 589 | 3
多谢，关于第四个问题，我用的是裂解液和wash/binding buffer (类似PBS) 1：1混合
。有更好的办法吗？ |
|
V********n
发帖数: 305 | 4 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
|
V********n
发帖数: 305 | 5 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
|
S******e
发帖数: 36 | 6 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
|
V********n
发帖数: 305 | 7 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
|
V********n
发帖数: 305 | 8 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
|
S******e
发帖数: 36 | 9 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
|
j******1
发帖数: 1315 | 10 promega的caspase-3/7 ApoONE的buffer配方是什么？它家的太贵了，我想用来筛选药
物，它家的buffer 实在用不起。也就是个细胞裂解和反应buffer，应该不难配吧。 |
|
h**********r
发帖数: 671 | 11 没有买现成的E.coli的lysis buffer.网上看了看，多种多样的。大家给个自己用的比
较好的recipe吧。裂解完之后测酶活的。多谢了！
包子伺候。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 12 关于用量，没有那么严格的。多一点少一点组织无所谓，关键是你得确认所有组织都被
溶掉了，否则就一方面堵树脂，另外一方面带入过多污染物。
你可以多加点裂解液，多处理一回，然后视需要全部倒进一个小管或者分成几个
管。
RNase一般比较皮实，所以没人能保证RLT buffer一定能灭活，该注意的地方还是要注
意的。
RLT |
|
b***a
发帖数: 147 | 13 从一个细胞株里提的蛋白，IgG做阴性对照，分别测蛋白A和蛋白B，用蛋白C做阳性对照。
结果是，input的lane里面都是干干净净，一点都没有，IgG的lane，可以见到重链，但
是向下的拖影很严重，蛋白A/B/C也是这样，拖影很严重，目的条带似有似无，第一次
做这几个蛋白，据说蛋白C是阳性对照，应该不错 的。
对了，A和B是核蛋白，我提的是总蛋白，就是提取的时候，用裂解液时间长一些，
vortex剧烈些。
觉得奇怪的是，为什么input里面干干净净，IP以后 反而有东西？这不是无中生有么？
我觉得从结果看，Western blot的过程应该没问题的，感觉是IP的问题，拖影可能是洗
脱的不够吧，可是这无中生有就没法解释了，要是一个抗体还可能是什么步骤错了，可
是三个抗体都这样，就奇怪了。。
盼高手指点一二。。。。 |
|
w******n
发帖数: 767 | 14 好像有人用NAOH裂解,再加HCl中和，连蛋白酶K都不用。 |
|
p******d
发帖数: 3737 | 15 实验要用到adenovirus做瞬时表达，用的细胞是p53 deficient的。一般用的
adenovirus应该是敲除了E1A 和E1B，这样应该在p53 deficient的细胞中不会复制吧？
要是用的细胞同时是p53和Rb deficient呢？是不是这样的细胞就不太可以用adeno做瞬
时表达了，否则都被裂解了？ |
|
p******d
发帖数: 3737 | 16 我不懂的是要是细胞同时p53和Rb deficient，感染了实验用adenovirus以后，病毒会
不会活跃复制呢？要是会复制，哪怕是低MOI，新产生的病毒会使本来的瞬时感染变成
持续感染？或者细胞都慢慢被裂解了？要是这样，adeno就不适合用在这样的目的细胞
上了吧？
还是说除了抑制p53和Rb，E1A和E1B还有别的功能。这样哪怕细胞缺失p53和Rb，Adeno
还是不能在这些细胞内复制？ |
|
c********r
发帖数: 189 | 17 打算做一个transcription factor的 co-IP，这个蛋白主要在核内表达，表达量不高，
RIPA buffer提的话，这个蛋白不溶解，还在pellet内。可以用高盐和denature来提，
但是就影响protein interaction了。
问问大伙，用什么方法裂解细胞或细胞核比较好？
很多paper中看到，cryolysis的方法比较好，但是实验室没有相关的设备。 |
|
s******a
发帖数: 472 | 18 碱裂解法提取的质粒能不能直接送测序呢？就是不过柱子的那种
我觉得可以，但是我的supervisor说不行。费半天口舌才让我送两个样本试一下。
他的理由是里面有细菌的genomic DNA和很多蛋白质，我怎么觉得站不住脚。 |
|
|
|
M**a
发帖数: 4816 | 21 check your PM box.
Good luck! |
|
|
s**a
发帖数: 293 | 23 也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试
1ug |
|
b******n
发帖数: 4225 | 24 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
|
p********e
发帖数: 61 | 25 WB抗体最重要，其他都次要。话又说回来，在哪儿抗体不重要呢？ELISA, IP, Flow,
IHC, ChIP, ChIP-seq, Fluorescence Microscopy.......如果抗体好，手笨点，硬件
差点，都是能做出来的。如果抗体不行，上帝他老人家来了也没辙。
其实生物男很多时间都花在尝试不同的抗体，求老板买更多抗体，以及向抗体公司投诉
上了。
可是如何选抗体呢？哥根据自己的经验体会，给大家提点建议。
在美国有300多家卖抗体的公司，全世界范围就更多了。可是我们常接触的就那么几家
。我把他们分成两类："包罗万象型"和"少而精型"。
最著名的“包罗万象型”公司有三家：AbCam, Sigma和Santa Cruz。这三位的产品也太
全了，无论你需要什么抗体，他们都有。至于是否能用，那就再说了。 我个人的经验
是：能用率大约有20％。 所以我很奇怪楼主会觉得AbCam抗体质量好。这三位大哥中
SantaCruz还算好点，毕竟便宜得多，给的量又足。万一赶上你走运遇到一支好的抗体
，够你用到当正教授了。
据我所知，AbCam和Sigma都不生产抗体，所有抗体都是来自OEM... 阅读全帖 |
|
i****g
发帖数: 3896 | 26 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
|
a******c
发帖数: 597 | 27 我一直觉得，用更strigent的washing的办法，其实远不如在binding上下功夫摸索更好
的IP条件。我遇到过的一个真实例子是，我已经用含有SDS的RIPA buffer作为细胞裂解
和washing beads的buffer了，control IP那里仍有signal。最后采用缩短Antibody
binding的时间的办法，最后解决了这个问题。 |
|
w******n
发帖数: 767 | 28 哈，我遇到过，提小鼠肝脏RNA,最后有一大坨白色的，溶不了。解决方法请按照TRIZOL
说明书严格操作。
1.裂解要充分，悬液要透明，看不到没溶的组织。
2.氯仿抽提离心时间要足够。
3.4度离心。
最后得到RNA应该是速溶的。 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 29 前几天去三藩开会，看到cayman有个新产品，叫做precellys 24.号称高通量快速裂解
样品，不损失dna,rna and protein.这个机器用陶瓷珠子在几秒钟内粉碎样品。可能贵
了点，大概机器要一万刀？ |
|
g********0
发帖数: 6201 | 30 给你推荐个小仪器 bullet blender
www.wisbiomed.com/ec/index.php?main_page=product_info&products_id=77
原理是用不锈钢珠直接在裂解液里高速击打粉碎组织
一次可同时处理24个样品，放在4度冷室里
心脏组织6分钟，肝组织2分钟，匀浆完基本看不到渣滓。本人亲自实践经历。 |
|
f*******e
发帖数: 354 | 31 为什么不能直接裂解在最终的IP buffer里头，如果可以用机械法等各种方法解决细胞
破碎的问题，求达人赐教 |
|
n**8
发帖数: 221 | 32 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
用的是RIPA buffer：
150 mM NaCl
1% NP40
0.5% of Sodium Deoxycholate
0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
50 mM Tris
请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
需不需要超声？
不甚感激！ |
|
k****o
发帖数: 589 | 33 之前用EcoRI切过吗？如bulletin说的，像是裂解步骤出的问题。 |
|
H****n
发帖数: 26 | 34 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1.... 阅读全帖 |
|
n******i
发帖数: 374 | 35 在乙酰化反应时，只要N-氨基是去保护的，侧链基团都是受到保护的，
当乙酰化完成后，再用TFA强酸裂解侧链保护基团，所以你无需担心这个问题 |
|
S******e
发帖数: 393 | 36 我转染是用的终浓度是60nM和120nM两个浓度，
48小时后收样裂解跑胶 |
|
b****r
发帖数: 17995 | 37 没有说ngs本身能早期诊断吧
不过确实应该是有可能做到的，ngs不光数据量大，而且敏感。比如如果知道肿瘤里什
么突变危险，可以对人血浆dna测序，只要肿瘤细胞有裂解的，血清里总有的肿瘤dna的
。实际上现在已经在用孕妇血里及极少量胎儿dna做胎儿染色体畸形的诊断了，我看好
这是ngs在临床上第一个产生大规模经济效益的突破口。有些地方这个技术已经上临床了 |
|
j****3
发帖数: 48 | 38 实验室有floxed的老鼠，打算注射Adnovirus给Cre recombinase...从一家公司买了一
个Ad-Cre,是有CMV promoter的，已经感染了HEK293细胞，收了细胞后（还没提纯），
现在想先看看病毒带的Cre序列有没有表达。跑了PCR可以看到带，但是WESTERN BLOT(
把HEK细胞裂解在RIPA buffer)用抗体却找不到Cre蛋白.咋回事呢？从没和病毒打过交
道，如果问的太傻，请尽量拍砖。。多谢 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 39 很多种方法，比方说有很多试剂是专门染色F-actin 的。
还有一个常用方法就是把细胞裂解了进行高速离心，
F-actin 会沉淀下来。 |
|
f*****f
发帖数: 195 | 40 拿细胞lysis做IP，假如不立即做的话，如下哪种好？
1 收集cell pellets后，LN2/-80
2 Lysisbuffer裂解后，LN2/-80 |
|
W*********n
发帖数: 775 | 41 蛋白样品有俩问题：
1） 蛋白样品在裂解之后就上凝胶电泳分离了，然后储存在4C 在洗脱液（30%甲醇，
10% 醋酸，60%水）。由于仪器室的质谱机器坏了修了一个月，然后那个操作的老师休
假了一个月，我就去做别的，耽搁下来了，现在已经在那里放了7个月了。继续用这个
胶来做，会不会影响实验结果？ （没有任何霉菌之类产生）。
２）当时跑电泳的胶是自己配的，结果配的时候上面的浓缩胶可能是用的丙烯酰胺的浓
度有些大，结果跑出来的胶在浓缩胶里面有一些分子量大的蛋白（只看见一条比较清晰
的条带，其他的基本看不见）， 但是每个样品的蛋白条带还是清晰的。请问，还能不
能用这个胶来做LC/MS/MS? 我一般把每个样品的一条胶切成10片， 然后每片分别处理
来做质谱。
样品比较珍贵，处理也很麻烦；所以如果不影响实验结果，我想继续用它。但是作质谱
的花费也很大，如果样品不用保证出好的结果，我还是想选择去另外准备一份。
谢谢！ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 42 你这个问题看来比我预想的还要复杂。
不过呢，看起来大部分红色的蛋白都在他们应该在的地方，而且颜色均匀没有
明显的亮点，所以不太可能有aggregate. 所以大概可以排除那个可能性了。
当然，要彻底排除那个可能性的话，你最好在细胞裂解后进行低速离心，
把沉淀物分出来后看看到底有没有你表达的蛋白。
第二，你说你分开制备ER和mitochondira 的时候看不到那个complex III
蛋白在ER fraction里。所以，我觉得最有可能的是用lysate 来做的时候，
可能就是因为把膜都打碎了混到了一起，导致出现了artifact. |
|
t*****2
发帖数: 213 | 43 看了你的描述，可能说明你的包涵体裂解的有问题。 不知道你用什么变性，尿素还是
盐酸胍？浓度多少？ |
|
w*******r
发帖数: 23 | 44 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
分感谢！ |
|
j******n
发帖数: 941 | 45
虽说1-3我都做过 但我个人不喜欢1 是因为总觉得胰酶消化本身就是一种刺激 尤其对
做信号转导的 谁能说清有没有影响？
2我也不常用，倒不是这个方法理论上有啥缺陷，只是我经常遇到细胞在PBS里面离心不
易，经常细胞不能完全形成pellet EP管里面还好点 15ml离心管尤其严重
3我比较常用 其实是省事 缺点是总会一定程度掺入PBS而稀释裂解液 可能会导致最后
蛋白浓度不够而影响实验 不过一般来说吸干净了影响不大
看你个人爱好了 |
|
p*****u
发帖数: 191 | 46 乙肝，国病，在过去里程碑式的研究发现中没有一个源于国内科学家的发现，无论
是病原发现、基因克隆、还是疫苗开发、或者治疗性的药物。北生所的李文辉课题组发
现乙肝新受体：NCTP基因，这个是一个有意义的研究，但是这个研究是里程碑式的发现
吗？是独一无二的开创，还是众多研究发现中的其中一员，新浪微博上有一位传染病专
家这样评论“一篇文章而已”。
从临床和疾病控制角度来说，控制乙肝的关键依然是提高疫苗接种的覆盖程度，这
是对群体最有效的方法，更多的精力和物力应该集中到提高疫苗保护率，降低疫苗失败
的研究原因中去。对于现症的慢乙肝患者，更重要的是提高医保的覆盖面积，让更多病
人有条件接受规范的、长疗程的抗病毒治疗。对于肝硬化和肝癌的患者，更重要的采用
综合的治疗措施，主要是外科方法来延长生命。正如10年前出现的SARS，传染病隔离措
施的重要性远远超越病原学研究。这些是大范围的政府和政策行为，卫生部的最大的工
作目标就是让每人每年享有300元的卫生服务。
饶毅教授近期对乙肝的研究进展进行了非常好的描述，饶教授列举了乙肝里程碑的
发现、列举了国内科学家在乙肝动物模型研究中的重... 阅读全帖 |
|
j******n
发帖数: 941 | 47
简单的说质谱是用来检测是哪个蛋白的。因为蛋白质胰酶裂解后会产生特定的片段，在
辅助电离后可被生物质谱鉴定，我们称为肽指纹图谱，简单的说就是特异的几组肽段分
子量，然后通过相关数
据库搜索可以得知是哪个蛋白。
对质谱鉴定技术来说是非常好可靠的，但是对你结果是否可靠则很难说，IP的条件，会
不会受到污染等直接决定了蛋白来源的可靠性。
具体到IP-MS是否好做，那要根据很多因素判断：蛋白结合强弱、质谱精度等等。通常
你能考染看到的条带鉴定起来都没问题，看不到的MS估计也没辙。
至于MS能否自己监督，任何仪器都多多少少离不开人的操作，机器自动化程度只是决定
效率而已。通常没有质谱的实验室也不会自己去搭建，一般学校都有相关core可以做 |
|
t**********8
发帖数: 223 | 48 谢谢你的热心回复。你冒似用的是两步裂解。你最后用的是RIPA buffer,不是SDS。我
的蛋白不用SDS可能抽不出来，我决定还是用1％SDS吧
cold
glycerol,
Add
mM
cold
0 |
|
w******a
发帖数: 65 | 49 是全细胞裂解液（whole cell lysates）还是Triton extracts 或者RIPA extracts？
我的个人经验，如果是Triton sample （通常用于co-IP），有一种可能性是抽提不完
全，药物刺激F-actin增加导致这一部分的骨架蛋白不溶于Triton lysis buffer。但如
果是WCL或者RIPA sample就要考虑其他的原因。 |
|
l***g
发帖数: 19 | 50 很奇怪啊，H460好像是肺癌细胞吧。我原来用过不同浓度（0-30uM）的cisplatin处理
过A549细胞36小时，细胞凋亡可以检测到cleaved PARP，beta-actin的条带不会受到影
响的，我可以检测出来。我是用的SDS sample buffer直接裂解的细胞。 |
|
