t****p
发帖数: 1504 | 1 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基
团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活
性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录DNA |
b******n
发帖数: 4225 | 2 Pacific Biosciences的可能问题：
1）DNA polymerase有3'-5'的外切酶活性从而保证高保真性。但是机器不会识别这个保
真过程，于是仍然多读了一个不存在于模板中的碱基出来
比如新合成的链理论上应该是 5'-ATCG-3'
但是DNA Polymerase开了个小差，错误合成了5'-AT-3'，
3'-5'的外切酶活性马上切掉这个无法正确配对的G
从而保证合成的序列仍然是 5'-ATCG-3'
但是机器读出来的可能会是 5'-ATGCG-3'
2）10 base/second，会不会太快了，机器将前后的信号混淆了或者没来得及读出来
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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a****o
发帖数: 1786 | 3 Thanks for sharing.
I took a nanocourse a few weeks ago. One co-director of BROAD Institute
compared a few major deep-sequencing platforms, including PB.
Helicos claim they are the true single molecule sequencing.
Pacific claim they are the true third generation sequencing.
Helicos already published a paper for direct sequencing RNA (poly A tailed,
3' end). with some modification, it is possible to sequnce other portions of
RNA directly.
Two important hurdles for deep dequencing:
1. DNA template
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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s***e
发帖数: 911 | 4 不可能的. AFM没这么高的精度解析sequence dependent conformation per bp. 以前
有另外一个思路, 是用外力把双链拉开. 因为sequence-dependent base pair
stability, 所以理论上拉开不通的base pair需要不同的力. sequence dependent
Unzipping force range在15-20 pN之间. 但是因为有大量的热噪音, 也作不成. 不过
我想如果能amplify sequence-dependent base pair energy, 同时在低温作unzipping
, 说不定能成. |
s******y
发帖数: 28562 | 5 因为蛋白和核酸的化学不一样。
核酸有一一配对，氨基酸没有
核酸有复制酶，氨基酸没有
而且更麻烦的是很多氨基酸都有posttranslational modification
如果氨基酸的测序有大的技术进展的话肯定又是一个诺贝尔奖
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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b*****h
发帖数: 783 | 6 Helico是目前商业化仪器种最好的，不过估计很快就要被这些新的仪器所超过。
更远的还有nanopore sequencing。
Oxford Nanopore 正在开发一种全新的测序系统。大概原理是在一个特殊板上打满了
nano尺寸的小孔，每个孔上面有一个dna外切酶，可以把测序样品dna一个一个碱基切割
下来。切下来的碱基会通过nano孔，而孔中是有微电流的。不同碱基通过孔时对电流的
改变是不同的，通过检测电流的变化来确定dna序列。（http://www.nanoporetech.com/sequences) |
c**********6
发帖数: 1173 | 7 helicos我看不出有什么希望来。
他们仪器太贵了，价格是illumina GA，454，和solid的两倍以上 （这是08年末的数据
，肯定他们的成本降低很多了现在，但是比其余三个贵是肯定的）
价格上的劣势导致他们现在的市场占有率太低了，估计现在市场上1000台，有500台是
illumina的，250台454，250台solid，helicos只有11台。 市场占有率低导致了不能进
一步推广，而且试剂上也赚不到钱。
他们的错误率相对而言还是最高的。他们目前的解决办法是做更多轮。
技术上我觉得他们还是有优势的，比如他们是唯一一个目前能直接做rna的。但是建立
在这样的技术优势上，还没有能打开市场，今后在别的竞争对手上来以后，就更难了。
看好PB，但是他们还要很好的解决S/N的问题。
oxford就难说了，这个idea都已经存在20年了。但是一直没有解决，也不知道什么时候
能解决呵呵
【在 b*****h 的大作中提到】
: Helico是目前商业化仪器种最好的，不过估计很快就要被这些新的仪器所超过。
: 更远的还有nanopore sequencing。
: Oxford Nanopore 正在开发一种全新的测序系统。大概原理是在一个特殊板上打满了
: nano尺寸的小孔，每个孔上面有一个dna外切酶，可以把测序样品dna一个一个碱基切割
: 下来。切下来的碱基会通过nano孔，而孔中是有微电流的。不同碱基通过孔时对电流的
: 改变是不同的，通过检测电流的变化来确定dna序列。（http://www.nanoporetech.com/sequences)
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s*********e
发帖数: 11 | 8 这个，现在出来了商业化运营的了吗？
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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h******e
发帖数: 1791 | 9 请问他们上市了吗？
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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s******s
发帖数: 13035 | 10 大家不要被高科技忽悠。技术上fancy不等于东西做的好，更不等于赚钱。
这玩意儿拖了一年多终于出现了, PacBIO第一季度加剧亏损
【在 h******e 的大作中提到】
: 请问他们上市了吗？
:
: SMRT
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z*******a
发帖数: 175 | |
i*****g
发帖数: 11893 | |
c**********6
发帖数: 1173 | 13 pacbio已经上市了。但是他们现在的error rate还是没有能够得到很好的解决
我个人感觉他们没有达到开始的预期
【在 h******e 的大作中提到】
: 请问他们上市了吗？
:
: SMRT
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c******r
发帖数: 3778 | 14 不错，回头好好学习一下
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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w******y
发帖数: 4871 | 15 cool
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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f*******e
发帖数: 628 | 16 PacBio 的 error rate 比别的二代测序大么？为什么？
【在 c**********6 的大作中提到】
: pacbio已经上市了。但是他们现在的error rate还是没有能够得到很好的解决
: 我个人感觉他们没有达到开始的预期
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p*u
发帖数: 2978 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 18 正想说这个呢
我想补充一下的是你说的孔不是“打”出来的
其实是一个膜蛋白六聚体
中间会形成一个孔
然后有东西从里面穿过的时候在膜上能测到不同的电流变化
他们公司上有两种构想
一种就是这个用外切酶切的
一种也是放一个DNA聚合酶在六聚体膜蛋白的顶上
DNA模板从孔中穿过
不过我没有弄明白那个是怎么来测序的
因为其实一直孔里都有东西
电流变化就没有了
（http://www.nanoporetech.com/sequences)
【在 b*****h 的大作中提到】
: Helico是目前商业化仪器种最好的，不过估计很快就要被这些新的仪器所超过。
: 更远的还有nanopore sequencing。
: Oxford Nanopore 正在开发一种全新的测序系统。大概原理是在一个特殊板上打满了
: nano尺寸的小孔，每个孔上面有一个dna外切酶，可以把测序样品dna一个一个碱基切割
: 下来。切下来的碱基会通过nano孔，而孔中是有微电流的。不同碱基通过孔时对电流的
: 改变是不同的，通过检测电流的变化来确定dna序列。（http://www.nanoporetech.com/sequences)
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 上市了
隔壁就有一台PacBio的
不过一直不知道原来是这么fancy的东西
去年年底组装起来的
【在 h******e 的大作中提到】
: 请问他们上市了吗？
:
: SMRT
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z*t
发帖数: 863 | 20 他家太坑爹了。。。机器总坏，加上我们这里genome center的效率，简直无敌了。。
。我们一个test sample愣是跑了1个月
【在 C*******e 的大作中提到】
: 上市了
: 隔壁就有一台PacBio的
: 不过一直不知道原来是这么fancy的东西
: 去年年底组装起来的
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z*t
发帖数: 863 | 21 他家太坑爹了。。。机器总坏，加上我们这里genome center的效率，简直无敌了。。
。我们一个test sample愣是跑了1个月
【在 C*******e 的大作中提到】
: 上市了
: 隔壁就有一台PacBio的
: 不过一直不知道原来是这么fancy的东西
: 去年年底组装起来的
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 ：）
还好我不用那个
你要操作那个东西么
【在 z*t 的大作中提到】
: 他家太坑爹了。。。机器总坏，加上我们这里genome center的效率，简直无敌了。。
: 。我们一个test sample愣是跑了1个月
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y****m
发帖数: 37 | 23 10 beta machine are in testing and in use
【在 h******e 的大作中提到】
: 请问他们上市了吗？
:
: SMRT
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p*l
发帖数: 1359 | 24 成像上他们应该用的不是confocal。confocal对单分子探测有点够呛。我印象里就是个wide field microscope，用EMCCD成像。
所谓zero-mode waveguides，就是激发光只可能在这个纳米大小的小孔内有，漏不出去。所以只有进入了这个小孔的荧分子才可能发光，其他在溶液里的荧光分子，根本不会有信号。成像上不需要考虑背景信号问题，一般的wide field fluorescence就可以了。
SMRT
【在 t****p 的大作中提到】
: 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会
: 认为他异想天开，没有一点生物的sense。
: 我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三
: 代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT
: ™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。
: 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解
: 记录整理一下。
: 要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
: 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子
: ”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时
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