C****1
发帖数: 89 | 1 新手我最近苦于纠结一个关于IP实验的问题，特发此帖向大家求教。
我的目的蛋白A如果在肿瘤细胞（此蛋白已证实该细胞里正常水平不表达）里过度表达
会含有FLAG tag（通过adenovirus vector infection）。我用此蛋白来pull down 细胞
里的另外一个蛋白B。我用FLAG 抗体IP, Western blot 检测此两种蛋白A和B。结果在
正常对照的样品发现anti－Flag 抗体也能非特异性的结合蛋白B，即在blot也能检测到
B的条带。
请问如何消除抗体非特异性结合其他蛋白，还是我在那些方面需要改进？谢谢。 |
s******r
发帖数: 2876 | 2 换一个Flag抗体。
新手我最近苦于纠结一个关于IP实验的问题，特发此帖向大家求教。
我的目的蛋白A如果在肿瘤细胞（此蛋白已证实该细胞里正常水平不表达）里过度表达
会含有FLAG tag（通过adnovirus vector infection）。我用此蛋白来pull down 细胞
里的另外一个蛋白B。我用FLAG 抗体IP, Western blot 检测此两种蛋白A和B。结果在
正常对照的样品发现anti－Flag 抗体也能非特异性的结合蛋白B，即在blot也能检测到
B的条带。
请问如何消除抗体非特异性结合其他蛋白，还是我在那些方面需要改进？谢谢。
【在 C****1 的大作中提到】
: 新手我最近苦于纠结一个关于IP实验的问题，特发此帖向大家求教。
: 我的目的蛋白A如果在肿瘤细胞（此蛋白已证实该细胞里正常水平不表达）里过度表达
: 会含有FLAG tag（通过adenovirus vector infection）。我用此蛋白来pull down 细胞
: 里的另外一个蛋白B。我用FLAG 抗体IP, Western blot 检测此两种蛋白A和B。结果在
: 正常对照的样品发现anti－Flag 抗体也能非特异性的结合蛋白B，即在blot也能检测到
: B的条带。
: 请问如何消除抗体非特异性结合其他蛋白，还是我在那些方面需要改进？谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 3 没有什么好办法。
要么换一个抗体，要么就换一个tag, 要么就换用anti- proteinB 的抗体
来做pulldown
【在 C****1 的大作中提到】
: 新手我最近苦于纠结一个关于IP实验的问题，特发此帖向大家求教。
: 我的目的蛋白A如果在肿瘤细胞（此蛋白已证实该细胞里正常水平不表达）里过度表达
: 会含有FLAG tag（通过adenovirus vector infection）。我用此蛋白来pull down 细胞
: 里的另外一个蛋白B。我用FLAG 抗体IP, Western blot 检测此两种蛋白A和B。结果在
: 正常对照的样品发现anti－Flag 抗体也能非特异性的结合蛋白B，即在blot也能检测到
: B的条带。
: 请问如何消除抗体非特异性结合其他蛋白，还是我在那些方面需要改进？谢谢。
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C****1
发帖数: 89 | 4 Thanks for the help. I will try the first suggestion next time. |
z*****k
发帖数: 86 | 5 个人感觉 FLAG的抗体非特异性很强
不如换一个吧
细胞
【在 C****1 的大作中提到】
: 新手我最近苦于纠结一个关于IP实验的问题，特发此帖向大家求教。
: 我的目的蛋白A如果在肿瘤细胞（此蛋白已证实该细胞里正常水平不表达）里过度表达
: 会含有FLAG tag（通过adenovirus vector infection）。我用此蛋白来pull down 细胞
: 里的另外一个蛋白B。我用FLAG 抗体IP, Western blot 检测此两种蛋白A和B。结果在
: 正常对照的样品发现anti－Flag 抗体也能非特异性的结合蛋白B，即在blot也能检测到
: B的条带。
: 请问如何消除抗体非特异性结合其他蛋白，还是我在那些方面需要改进？谢谢。
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p*f
发帖数: 77 | 6 LZ needs to have functional analysis results as basis to develop a story.
Co-IP can only be used as a support.
As sunnyday said, LZ should use a different Flag Ab or perform reverse IP.
Co-staining is also good to show potential interactions.
【在 s******y 的大作中提到】
: 没有什么好办法。
: 要么换一个抗体，要么就换一个tag, 要么就换用anti- proteinB 的抗体
: 来做pulldown
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