s******y
发帖数: 28562 | 1 我们需要homogenize 一批量很小的放射标志过的cultured cells,
并把chromosome DNA 打碎（好来做pulldown).
但是用sonicator 或者针头都不是很好的选择，因为sonicator 容易把样品
溅出来，而针头会有很多残留，不是很适合做quantitative analysis.
我知道有一些cell shredder的小管子是用来制备RNA sample的，可以把
细胞完全裂解。不知道有没有类似的东西可以用来裂解细胞制备总蛋白的？
有没有人知道？ 谢谢了！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 从技术上来讲，作这样的小管子其实一点都不难！我都可以设计出来。。。
但就是从来没有见过样品。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要homogenize 一批量很小的放射标志过的cultured cells,
: 并把chromosome DNA 打碎（好来做pulldown).
: 但是用sonicator 或者针头都不是很好的选择，因为sonicator 容易把样品
: 溅出来，而针头会有很多残留，不是很适合做quantitative analysis.
: 我知道有一些cell shredder的小管子是用来制备RNA sample的，可以把
: 细胞完全裂解。不知道有没有类似的东西可以用来裂解细胞制备总蛋白的？
: 有没有人知道？ 谢谢了！
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a***e
发帖数: 1010 | |
s******y
发帖数: 28562 | 4 不行，这样不能打碎DNA, 裂解液会粘的很，不合适来做pulldown.
但是我们又不想用sonicator, 因为是放射标记的细胞。
这个大家都是怎么处理的啊？
也不能用DNase, 因为要做一个降解的非常快的蛋白，需要及时处理样品，
不能慢慢的用DNase 处理
【在 a***e 的大作中提到】
: low salt + pipette ?
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a***e
发帖数: 1010 | 5 cell shredder from Qiagen?
I think that one is also too big for you. |
s******y
发帖数: 28562 | 6 Qiagen 那个是用来制备RNA的吧？ 能用来制备蛋白么？
关键是，那个管子可以打碎chromosome DNA么？
【在 a***e 的大作中提到】
: cell shredder from Qiagen?
: I think that one is also too big for you.
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a***e
发帖数: 1010 | 7 depends on what is your donwstream step.
(1) if want to pull down DNA (such as ChIP), u can crosslink first, then add
DNase (instead of sonication). in this case, your protein should be stable.
(2) if just IP protein, add high salt to extract your protein should be safe
. |
a***e
发帖数: 1010 | |
s******y
发帖数: 28562 | 9 I need to do protein IP
add
stable.
safe
【在 a***e 的大作中提到】
: depends on what is your donwstream step.
: (1) if want to pull down DNA (such as ChIP), u can crosslink first, then add
: DNase (instead of sonication). in this case, your protein should be stable.
: (2) if just IP protein, add high salt to extract your protein should be safe
: .
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a***e
发帖数: 1010 | 10 then why care about DNA?
【在 s******y 的大作中提到】
: I need to do protein IP
:
: add
: stable.
: safe
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s******y
发帖数: 28562 | 11 因为DNA很粘，会影响pulldown
【在 a***e 的大作中提到】
: then why care about DNA?
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a***e
发帖数: 1010 | 12 (1) if your protein localizes in cytoplasm, a gentle lysis will only release
your protein to the solution, but not chromatin DNA.
(2) if your protein accumulates in nucleus but not sticks to DNA, you can
try several rounds freeze-thaw in some buffer with detergent. Then spin down
. The chromatin DNA will stay in pellet.
(3) and you can always add a pre-clear step with beads only. |
s******y
发帖数: 28562 | 13 谢谢，但是这些策略对我们没有用，因为我们的蛋白是在细胞骨架里面的，
如果用温和裂解液的话，超过一半的蛋白就和actin filaments 一起在低速离心
下沉到pellet里了。要把所有蛋白都分出来的话我现在是用8M urea, 但是这样
就成了一个gel-like structure, 我也试过pre-clear step with beads，
但是发现根本没有用，因为整个溶液（就是一个胶体结构）都粘在resin bead上，
用普通的desktop centrifuge根本分不开。
release
down
【在 a***e 的大作中提到】
: (1) if your protein localizes in cytoplasm, a gentle lysis will only release
: your protein to the solution, but not chromatin DNA.
: (2) if your protein accumulates in nucleus but not sticks to DNA, you can
: try several rounds freeze-thaw in some buffer with detergent. Then spin down
: . The chromatin DNA will stay in pellet.
: (3) and you can always add a pre-clear step with beads only.
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a****o
发帖数: 1786 | 14 http://www.sonicator.com/site/xl-2000.aspx
如果用horn和screw-cap tube，不会溅出来
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要homogenize 一批量很小的放射标志过的cultured cells,
: 并把chromosome DNA 打碎（好来做pulldown).
: 但是用sonicator 或者针头都不是很好的选择，因为sonicator 容易把样品
: 溅出来，而针头会有很多残留，不是很适合做quantitative analysis.
: 我知道有一些cell shredder的小管子是用来制备RNA sample的，可以把
: 细胞完全裂解。不知道有没有类似的东西可以用来裂解细胞制备总蛋白的？
: 有没有人知道？ 谢谢了！
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s******y
发帖数: 28562 | 15 嗯，这个可能可以解决我们的问题，就是我得看看我们学校里有没有实验室
有这个东西......
【在 a****o 的大作中提到】
: http://www.sonicator.com/site/xl-2000.aspx
: 如果用horn和screw-cap tube，不会溅出来
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a***e
发帖数: 1010 | 16 yeah, horn and screw-cap tube can solve your problem. |
D*********t
发帖数: 370 | 17 How about this:
http://www.nextadvance.com/biology_laboratory_instruments_rockers_shakers/Bullet_Blender_lyse_
homogenize_disrupt_cells_tissue.htm
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要homogenize 一批量很小的放射标志过的cultured cells,
: 并把chromosome DNA 打碎（好来做pulldown).
: 但是用sonicator 或者针头都不是很好的选择，因为sonicator 容易把样品
: 溅出来，而针头会有很多残留，不是很适合做quantitative analysis.
: 我知道有一些cell shredder的小管子是用来制备RNA sample的，可以把
: 细胞完全裂解。不知道有没有类似的东西可以用来裂解细胞制备总蛋白的？
: 有没有人知道？ 谢谢了！
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v*******a
发帖数: 759 | |
a****o
发帖数: 1786 | 19 这个可以破碎细胞，不一定能把染色质打断得足够小
【在 D*********t 的大作中提到】
: How about this:
: http://www.nextadvance.com/biology_laboratory_instruments_rockers_shakers/Bullet_Blender_lyse_
: homogenize_disrupt_cells_tissue.htm
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a****o
发帖数: 1786 | 20 This one is even better than Misonix, except it handles fewer samples.
【在 v*******a 的大作中提到】
: biorupter should work
: http://www.diagenode.com/pages/bioruptor200.html#Applications
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s******r
发帖数: 2876 | 21 能不能用drug抑制actin filaments?
谢谢，但是这些策略对我们没有用，因为我们的蛋白是在细胞骨架里面的，
如果用温和裂解液的话，超过一半的蛋白就和actin filaments 一起在低速离心
下沉到pellet里了。要把所有蛋白都分出来的话我现在是用8M urea, 但是这样
就成了一个gel-like structure, 我也试过pre-clear step with beads，
但是发现根本没有用，因为整个溶液（就是一个胶体结构）都粘在resin bead上，
用普通的desktop centrifuge根本分不开。
release
down
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢，但是这些策略对我们没有用，因为我们的蛋白是在细胞骨架里面的，
: 如果用温和裂解液的话，超过一半的蛋白就和actin filaments 一起在低速离心
: 下沉到pellet里了。要把所有蛋白都分出来的话我现在是用8M urea, 但是这样
: 就成了一个gel-like structure, 我也试过pre-clear step with beads，
: 但是发现根本没有用，因为整个溶液（就是一个胶体结构）都粘在resin bead上，
: 用普通的desktop centrifuge根本分不开。
:
: release
: down
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s******y
发帖数: 28562 | 22 I tired that, and found out not suitable.
It takes at least 20 to 30 minutes to completely disrupt all the actin
filaments, but my target protein has a half time much much shorter than that
.
【在 s******r 的大作中提到】
: 能不能用drug抑制actin filaments?
:
: 谢谢，但是这些策略对我们没有用，因为我们的蛋白是在细胞骨架里面的，
: 如果用温和裂解液的话，超过一半的蛋白就和actin filaments 一起在低速离心
: 下沉到pellet里了。要把所有蛋白都分出来的话我现在是用8M urea, 但是这样
: 就成了一个gel-like structure, 我也试过pre-clear step with beads，
: 但是发现根本没有用，因为整个溶液（就是一个胶体结构）都粘在resin bead上，
: 用普通的desktop centrifuge根本分不开。
: release
: down
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s******r
发帖数: 2876 | 23 加上MG132行不行？
I tired that, and found out not suitable.
It takes at least 20 to 30 minutes to completely disrupt all the actin
filaments, but my target protein has a half time much much shorter than that
.
【在 s******y 的大作中提到】
: I tired that, and found out not suitable.
: It takes at least 20 to 30 minutes to completely disrupt all the actin
: filaments, but my target protein has a half time much much shorter than that
: .
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s******y
发帖数: 28562 | 24 芬特，我们本来就是要做pulse chase,
加上MG132就完蛋了。
that
【在 s******r 的大作中提到】
: 加上MG132行不行？
:
: I tired that, and found out not suitable.
: It takes at least 20 to 30 minutes to completely disrupt all the actin
: filaments, but my target protein has a half time much much shorter than that
: .
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