z**m
发帖数: 50 | 1 本人生物菜鸟，请教版上牛人，万分感谢！！！
想检测老鼠体外培养细胞中病毒感染前期，病毒RNA是否和目标蛋白结合成RNP complex。
目标蛋白IP抗体available，想检测的viral RNA 为40－50 nt的leader sequence （
LeRNA）。
做了些homework，准备用目标蛋白pulldown，PK处理，纯化RNA组分，northern检测。
问题：
1）由于个人原因，不想用同位素标记探真做northern，不知可否用dig－probe做
northern，主要担心RNA量太少，不知道dig的灵敏度是否足够。
2）由于目标RNA只有40－50 nt，请问northern 的DNA或RNA probe是否只能是这40－
50nt的序列？如果probe只有40－50 nt，是否太短？尤其是用dig－UTP标记？可否适当
延长probe至200 nt－300nt（后续sequence是病毒的另外一个高表达基因，如果该基因
mRNA也和目标蛋白结合最好，如果不和目标蛋白结合，是否延长的probe检测不到40－50nt的leRNA？）
3）除了northern， |
a***e
发帖数: 1010 | 2 (1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
increase the sensitivity of your probe (~10x).
(2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
(3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
northern blot
(4) deep sequencing w/ or w/o cloning |
z**m
发帖数: 50 | 3 谢谢了！能再请问一下tagman－qPCR具体有什么注意事项吗？LNA probe是不是可以避
免同位素?包子感谢了！
【在 a***e 的大作中提到】
: (1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
: increase the sensitivity of your probe (~10x).
: (2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
: with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
: (3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
: northern blot
: (4) deep sequencing w/ or w/o cloning
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a***e
发帖数: 1010 | 4 haven't used taqman-qPRC myself.
LNA probe is still p32 labeling, haven't tried that myself either. |
