j*****q
发帖数: 82 | 1 plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
全溶解。有什么好的办法吗？ |
w******e
发帖数: 1187 | 2 did u speed vac? completely dry pellets are hard to dissolve. did you get
very high conc. in your solution? (>1ug/ul)
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
: 全溶解。有什么好的办法吗？
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j*****q
发帖数: 82 | 3 vac is vacume?
i washed the pellet with 70% EtOH and dry in air 5 min, so it is not too dry.
then dissovle the pellet in water. i think i put enough water. the
concentration will not be higher than 200ug/ml.but a samll damn pellet is
still floating in the water even after 37 degree overnight.
any one has better ideas? |
i*********t
发帖数: 78 | 4 do not use water, pH is lower than 7. use 50mM tris buffer ph8.0. |
i*********t
发帖数: 78 | 5 do not use water, pH is lower than 7. use 50mM tris buffer ph8.0. |
t****p
发帖数: 1504 | 6 我用qiagen的中抽大抽，用isopropanol沉淀，ethanol wash后，用vacuun吸上清后立
即用水溶解（TE溶解也一样），稍微干燥一点都没法溶解（这个ethanol肯定没有完全
去掉）。跟质粒是不是很大没有关系。
不知道有谁有好办法。
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
: 全溶解。有什么好的办法吗？
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p******i
发帖数: 1092 | 7 以前用過QIAGEN的 HiSpeed Plasmid Maxi Kit，比MAXI貴一些
最後一步再過一個柱子，叫 QIAprecipitator，跳過了PELLET那一步
結果還不錯；
只不過由於最後需要把DNA從QIAprecipitator濾出來，終體積可能有點大——終濃度可
能比平時低一些。
土翁大俠不妨試試？
【在 t****p 的大作中提到】
: 我用qiagen的中抽大抽，用isopropanol沉淀，ethanol wash后，用vacuun吸上清后立
: 即用水溶解（TE溶解也一样），稍微干燥一点都没法溶解（这个ethanol肯定没有完全
: 去掉）。跟质粒是不是很大没有关系。
: 不知道有谁有好办法。
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c******r
发帖数: 3778 | 8 我一般是4度overnight，都没有问题。
实在不行还有个办法，95度，3分钟。。。不过我没试过，不知道行不行？反正DNA不怕
加热一下。RNA我知道的溶解办法是62度（？好像）overnight，因为RNase在这个温度
下失去活性。再高我就不知道了。
【在 t****p 的大作中提到】
: 我用qiagen的中抽大抽，用isopropanol沉淀，ethanol wash后，用vacuun吸上清后立
: 即用水溶解（TE溶解也一样），稍微干燥一点都没法溶解（这个ethanol肯定没有完全
: 去掉）。跟质粒是不是很大没有关系。
: 不知道有谁有好办法。
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k*****o
发帖数: 1486 | 9 离心完倒的时候尽量倒干净.
稍微大点的DNA你只要vac一会儿就可以了,不要让它completely dry,反正你用的是70%
Ethanol,里面最先出来的都是ethanol,留下的那点儿都是纯水(如果你做70%Ethanol用
的是ddH2O的话).
基本所有对大DNA提取的protocol都是说不要蒸干.不过才16kb的话干了也无所谓,加水
静置overnight自己就融了,不行枪吹打两下就OK了.要是不溶的话就是你DNA提的不纯，
16kbDNA提出来应该很透明，一砣一砣的那些基本是蛋白。
为了看里面酒精是否全部蒸干,可以用直接鼻子上去闻,你可以闻出来有没有酒精的. |
t****p
发帖数: 1504 | 10 不溶的话怎么整都不行。95度难道不会导致DNA变性？下面还怎么做酶切啥的？
【在 c******r 的大作中提到】
: 我一般是4度overnight，都没有问题。
: 实在不行还有个办法，95度，3分钟。。。不过我没试过，不知道行不行？反正DNA不怕
: 加热一下。RNA我知道的溶解办法是62度（？好像）overnight，因为RNase在这个温度
: 下失去活性。再高我就不知道了。
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c******r
发帖数: 3778 | 11 。。。DNA变性？DNA变性又不影响酶切，也不影响PCR，只要不断就可以啊。反正一降
温不就重新anneal了吗？如果担心可以慢慢降温啊，比如放60度10分钟。不要95度然后
直接放冰上，那个会影响DNA的annealing。
不过加热好不好使我真的没直接试验过
【在 t****p 的大作中提到】
: 不溶的话怎么整都不行。95度难道不会导致DNA变性？下面还怎么做酶切啥的？
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t******y
发帖数: 716 | 12 室温沉淀还是-20度沉淀？
我有一次-80度沉淀，最后DNA怎么也不能溶解了。
【在 t****p 的大作中提到】
: 我用qiagen的中抽大抽，用isopropanol沉淀，ethanol wash后，用vacuun吸上清后立
: 即用水溶解（TE溶解也一样），稍微干燥一点都没法溶解（这个ethanol肯定没有完全
: 去掉）。跟质粒是不是很大没有关系。
: 不知道有谁有好办法。
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t****p
发帖数: 1504 | 13 -20
【在 t******y 的大作中提到】
: 室温沉淀还是-20度沉淀？
: 我有一次-80度沉淀，最后DNA怎么也不能溶解了。
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t****p
发帖数: 1504 | 14 质粒这么大的DNA可以做到完全无错误复性吗？内切酶可以切单链DNA吗?
【在 c******r 的大作中提到】
: 。。。DNA变性？DNA变性又不影响酶切，也不影响PCR，只要不断就可以啊。反正一降
: 温不就重新anneal了吗？如果担心可以慢慢降温啊，比如放60度10分钟。不要95度然后
: 直接放冰上，那个会影响DNA的annealing。
: 不过加热好不好使我真的没直接试验过
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c******r
发帖数: 3778 | 15 多数内切酶切不了单链DNA，好像有个别的可以，具体不记得了，要查一下。
anneal我觉得应该没问题吧？你说呢？我没试过
【在 t****p 的大作中提到】
: 质粒这么大的DNA可以做到完全无错误复性吗？内切酶可以切单链DNA吗?
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P******m
发帖数: 21 | 16 isopropanol回收时离心是室温还是4度，要是不小心4度离心的话基本上很难溶。 |
t******y
发帖数: 716 | 17 我一般室温沉淀，4度离心，最后的pullet很干也能够溶解到水里。 |
l*********s
发帖数: 5409 | 18 Protein coprecipitation?
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
: 全溶解。有什么好的办法吗？
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m*****z
发帖数: 1451 | 19 genomic DNA太干也不好溶，可能要溶overnight，不过你16kb，不算大。
估计是蛋白没除尽共沉淀了。
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
: 全溶解。有什么好的办法吗？
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n********k
发帖数: 2818 | 20 time to make up some molecular biology:)))...were u biology major in college
?
【在 t****p 的大作中提到】
: 质粒这么大的DNA可以做到完全无错误复性吗？内切酶可以切单链DNA吗?
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n********k
发帖数: 2818 | 21 very likely proteins...I overdry my RNA/DNA all the times as I don't like
any trace of ethanol, rarely have any
problems with non-genome DNA or small amount genome DNA/RNA...BTW, pure DNA/
RNA is transparent,
hard to see...if white/color stuff being seen, it is non-purity(Salt, and/or
proteins etc)...
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasmid很大，16kb， linearize以后用isopropanol回收，沉淀的DNA用水老是不能完
: 全溶解。有什么好的办法吗？
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j*****q
发帖数: 82 | 22 dna是maxi kit纯化出来的。
定了个qiagen的kit，纯化大片段的，看看能回收多少dna |
