s******y 发帖数: 220 | 1 我做WB detect 心肌细胞的CamKII,(50-60KDa)我用的一抗是mouse host的。结果二
抗总是识
别老鼠的IgG, 在25 和50Kda 处有带。也不知道目标蛋白有没有。
除了换一抗,有什么别的解决方法吗?
多谢了。 |
W****C 发帖数: 1937 | 2 2抗当然要识别老鼠IGG. 你可以找个只识别25kd轻链的2抗。
跑native gel可能也会保持igg150kd,减少你样品中50kd的igg重链, 不过总是还有些
的。 |
s******y 发帖数: 220 | 3 多谢回复,请问能推荐个好用的 “只识别25kd轻链的2抗“吗?
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 2抗当然要识别老鼠IGG. 你可以找个只识别25kd轻链的2抗。 : 跑native gel可能也会保持igg150kd,减少你样品中50kd的igg重链, 不过总是还有些 : 的。
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f*********r 发帖数: 1233 | 4 你这是wb,又不是ip,怎么会有那么大的IgG干扰?
再说,心肌(无论是细胞培养还是直接取活体)里也没有那么大量的IgG。
而且一抗也不是识别IgG用的,就算一抗不好,也不应该只在IgG处出杂带。
方法:阳性对照和阴性对照。
真正阳性条带跟杂带应该有少许分子量差别。跑胶时间长一点,条带分得开一点,可以
分清。如果是用买来的胶,胶越老,越不容易把条带分开。另外,可以适当增加
running buffer里的tris,有助于分清条带。
阴性对照可以采用
1)完全无关样品(或者完全不表达目标蛋白的组织或细胞)
2)完全无样品(只上loading buffer)
3)完全无一抗
4)不相关一抗(包括不相关mouse一抗,或者相关或不相关的rabbit一抗)
几个结果放在一起分析,就能判断出是否是杂带,以及杂带是谁带来的。
另,如果是取活体心脏,一定要把残余的血液清洗干净,蛋白提取液争取做到淡黄色,
而不是橘红色。血液当中IgG是很高的。 |
Z**********g 发帖数: 222 | 5 可能是你样品的问题,估计你样品混了太多血液成分?当然换一抗host,从而换掉二抗应该可以解决.
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做WB detect 心肌细胞的CamKII,(50-60KDa)我用的一抗是mouse host的。结果二 : 抗总是识 : 别老鼠的IgG, 在25 和50Kda 处有带。也不知道目标蛋白有没有。 : 除了换一抗,有什么别的解决方法吗? : 多谢了。
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s******y 发帖数: 220 | 6 多谢,我会从control入手的~
【在 f*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你这是wb,又不是ip,怎么会有那么大的IgG干扰? : 再说,心肌(无论是细胞培养还是直接取活体)里也没有那么大量的IgG。 : 而且一抗也不是识别IgG用的,就算一抗不好,也不应该只在IgG处出杂带。 : 方法:阳性对照和阴性对照。 : 真正阳性条带跟杂带应该有少许分子量差别。跑胶时间长一点,条带分得开一点,可以 : 分清。如果是用买来的胶,胶越老,越不容易把条带分开。另外,可以适当增加 : running buffer里的tris,有助于分清条带。 : 阴性对照可以采用 : 1)完全无关样品(或者完全不表达目标蛋白的组织或细胞) : 2)完全无样品(只上loading buffer)
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s******y 发帖数: 220 | 7 我已经尽量排血了,我还perfuse了近20分钟了,就是为了把血液排走。
最后滴下来的都没有血色啦。
不知道怎么还这样。
应该可以解决.
【在 Z**********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 可能是你样品的问题,估计你样品混了太多血液成分?当然换一抗host,从而换掉二抗应该可以解决.
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