s******y
发帖数: 220 | 1 我做WB detect 心肌细胞的CamKII，（50-60KDa）我用的一抗是mouse host的。结果二
抗总是识
别老鼠的IgG， 在25 和50Kda 处有带。也不知道目标蛋白有没有。
除了换一抗，有什么别的解决方法吗？
多谢了。 |
W****C
发帖数: 1937 | 2 2抗当然要识别老鼠IGG. 你可以找个只识别25kd轻链的2抗。
跑native gel可能也会保持igg150kd，减少你样品中50kd的igg重链， 不过总是还有些
的。 |
s******y
发帖数: 220 | 3 多谢回复，请问能推荐个好用的 “只识别25kd轻链的2抗“吗？
【在 W****C 的大作中提到】
: 2抗当然要识别老鼠IGG. 你可以找个只识别25kd轻链的2抗。
: 跑native gel可能也会保持igg150kd，减少你样品中50kd的igg重链， 不过总是还有些
: 的。
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f*********r
发帖数: 1233 | 4 你这是wb，又不是ip，怎么会有那么大的IgG干扰？
再说，心肌（无论是细胞培养还是直接取活体）里也没有那么大量的IgG。
而且一抗也不是识别IgG用的，就算一抗不好，也不应该只在IgG处出杂带。
方法：阳性对照和阴性对照。
真正阳性条带跟杂带应该有少许分子量差别。跑胶时间长一点，条带分得开一点，可以
分清。如果是用买来的胶，胶越老，越不容易把条带分开。另外，可以适当增加
running buffer里的tris，有助于分清条带。
阴性对照可以采用
1）完全无关样品（或者完全不表达目标蛋白的组织或细胞）
2）完全无样品（只上loading buffer）
3）完全无一抗
4）不相关一抗（包括不相关mouse一抗，或者相关或不相关的rabbit一抗）
几个结果放在一起分析，就能判断出是否是杂带，以及杂带是谁带来的。
另，如果是取活体心脏，一定要把残余的血液清洗干净，蛋白提取液争取做到淡黄色，
而不是橘红色。血液当中IgG是很高的。 |
Z**********g
发帖数: 222 | 5 可能是你样品的问题,估计你样品混了太多血液成分?当然换一抗host,从而换掉二抗应该可以解决.
【在 s******y 的大作中提到】
: 我做WB detect 心肌细胞的CamKII，（50-60KDa）我用的一抗是mouse host的。结果二
: 抗总是识
: 别老鼠的IgG， 在25 和50Kda 处有带。也不知道目标蛋白有没有。
: 除了换一抗，有什么别的解决方法吗？
: 多谢了。
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s******y
发帖数: 220 | 6 多谢，我会从control入手的～
【在 f*********r 的大作中提到】
: 你这是wb，又不是ip，怎么会有那么大的IgG干扰？
: 再说，心肌（无论是细胞培养还是直接取活体）里也没有那么大量的IgG。
: 而且一抗也不是识别IgG用的，就算一抗不好，也不应该只在IgG处出杂带。
: 方法：阳性对照和阴性对照。
: 真正阳性条带跟杂带应该有少许分子量差别。跑胶时间长一点，条带分得开一点，可以
: 分清。如果是用买来的胶，胶越老，越不容易把条带分开。另外，可以适当增加
: running buffer里的tris，有助于分清条带。
: 阴性对照可以采用
: 1）完全无关样品（或者完全不表达目标蛋白的组织或细胞）
: 2）完全无样品（只上loading buffer）
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s******y
发帖数: 220 | 7 我已经尽量排血了，我还perfuse了近20分钟了，就是为了把血液排走。
最后滴下来的都没有血色啦。
不知道怎么还这样。
应该可以解决.
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 可能是你样品的问题,估计你样品混了太多血液成分?当然换一抗host,从而换掉二抗应该可以解决.
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