w******e
发帖数: 1187 | 1 最简单的biotinylated oligo往avidin NP上conjugate，yield巨低。。。
请教biotin-avidin interaction 会很挑buffer/etc condition吗？ |
y******8
发帖数: 1764 | 2 Have you tried other methods?
Single biotinylation could be insufficient. |
T**********t
发帖数: 1604 | 3 我用的是pH 7.4的20mM Tris Acetate buffer，还含了140mM的NaCl和5mM KCl, 1mM
CaCl2, 1mM MgCl2
这个recipe应该是从这篇paper来的：Bock et al. Nature 1992. (355)564-6. 这篇
paper不是用biotin-streptavidin interaction，但是我们就用这个条件做好像没啥太
大问题，至少bind得貌似挺好。
你有没有做个positive control看看是不是你的nanoparticle或者labeled oligo本身
的问题啊？biotin-avidin的binding应该是不太挑条件的，要不然就不会应用那么广了
。 |
w******e
发帖数: 1187 | 4 by other methods you mean other than biotin-avidin? I chose this
as I thought it's the easiest...
I didn't know that... do you know the reason ? thx!
【在 y******8 的大作中提到】
: Have you tried other methods?
: Single biotinylation could be insufficient.
|
w******e
发帖数: 1187 | 5 thx a lot! I also assume the interaction to be robust, so I didn't
use the recommended buffer condition.... How long do you let the incubation
go? did you do NP conjugation or slide? How did you measure conjugation
efficiency? I had to use qRT-PCR everytime:(
sorry for more qs:P
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我用的是pH 7.4的20mM Tris Acetate buffer，还含了140mM的NaCl和5mM KCl, 1mM
: CaCl2, 1mM MgCl2
: 这个recipe应该是从这篇paper来的：Bock et al. Nature 1992. (355)564-6. 这篇
: paper不是用biotin-streptavidin interaction，但是我们就用这个条件做好像没啥太
: 大问题，至少bind得貌似挺好。
: 你有没有做个positive control看看是不是你的nanoparticle或者labeled oligo本身
: 的问题啊？biotin-avidin的binding应该是不太挑条件的，要不然就不会应用那么广了
: 。
|
y******8
发帖数: 1764 | 6 不知道你要多高的效率？双生物素偶联效果也许会好很多。
另外，提高反应温度也许会有帮助。
没想过用amine group吗？
【在 w******e 的大作中提到】
: by other methods you mean other than biotin-avidin? I chose this
: as I thought it's the easiest...
:
: I didn't know that... do you know the reason ? thx!
|
w******e
发帖数: 1187 | 7 起码希望有一小半能conjugation上吧。amine group也考虑过，不过是不是
只能在synthesis时加上？post synthesis往RNA上加amine容易吗？
谢谢！
【在 y******8 的大作中提到】
: 不知道你要多高的效率？双生物素偶联效果也许会好很多。
: 另外，提高反应温度也许会有帮助。
: 没想过用amine group吗？
|
y******8
发帖数: 1764 | 8 直接合成不是更好吗？
不太清楚你的oligo是什么性质的。加Biotin-T并不是很有效的反应，一般都还要再PCR
扩增。如果做imaging，要用多级反应放大信号。
【在 w******e 的大作中提到】
: 起码希望有一小半能conjugation上吧。amine group也考虑过，不过是不是
: 只能在synthesis时加上？post synthesis往RNA上加amine容易吗？
: 谢谢！
|
w******e
发帖数: 1187 | 9 是这样的：我的RNA是2'-F modified aptamer，80base左右，据说找公司合成
很贵（不过也没问过）。我现在加biotin是用kit加在3’end。即使找人合成
也只敢往5’/3’上加，加到中间怕破坏结构：（
PCR
【在 y******8 的大作中提到】
: 直接合成不是更好吗？
: 不太清楚你的oligo是什么性质的。加Biotin-T并不是很有效的反应，一般都还要再PCR
: 扩增。如果做imaging，要用多级反应放大信号。
|
T**********t
发帖数: 1604 | 10 我做30min的incubation.
我用的是dynal beads，应该没有到nano的级别吧，估计微米级？
binding efficiency我就是测一下binding前后的UV差值。我做得没那么精细，就是毛
估估差不多就好了，反正是library，多一点少一点看不大出来。。。
incubation
【在 w******e 的大作中提到】
: thx a lot! I also assume the interaction to be robust, so I didn't
: use the recommended buffer condition.... How long do you let the incubation
: go? did you do NP conjugation or slide? How did you measure conjugation
: efficiency? I had to use qRT-PCR everytime:(
: sorry for more qs:P
|
y******8
发帖数: 1764 | 11 我的直觉是加biotin反应不完全。
建议直接合成。
猜想，可以用一个反义短DNA链做模板，用polymerase加多个biotin-T在3’端。
如果成功了，记得给个包子。
【在 w******e 的大作中提到】
: 是这样的：我的RNA是2'-F modified aptamer，80base左右，据说找公司合成
: 很贵（不过也没问过）。我现在加biotin是用kit加在3’end。即使找人合成
: 也只敢往5’/3’上加，加到中间怕破坏结构：（
:
: PCR
|
w******e
发帖数: 1187 | 12 en dynal beads are at um level. maybe I should try that too...
I don't have much biotinylated oligo to begin with, so UV won't be accurate
for me...
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我做30min的incubation.
: 我用的是dynal beads，应该没有到nano的级别吧，估计微米级？
: binding efficiency我就是测一下binding前后的UV差值。我做得没那么精细，就是毛
: 估估差不多就好了，反正是library，多一点少一点看不大出来。。。
:
: incubation
|
w******e
发帖数: 1187 | 13 thanks for the suggestion. I'm been struggling whether should conjugate
my primer for the aptamer to the beads and then use base pairing, as
in theory that may affect structure too:(
【在 y******8 的大作中提到】
: 我的直觉是加biotin反应不完全。
: 建议直接合成。
: 猜想，可以用一个反义短DNA链做模板，用polymerase加多个biotin-T在3’端。
: 如果成功了，记得给个包子。
|
