C*******e
发帖数: 4348 | 1 rt
跑SEC遇到一个情况
样品里有3个蛋白，100 kDa，60 kDa，25 kDa
然后收集的洗脱峰跑胶发现
60 kDa先出来
再后来出来的是100 kDa和25 kDa一起
有什么可能会这样呢？
首先我肯定100 kDa不是25 kDa蛋白的oligomer形式
有wb及urea变性跑胶为证 |
s*******n
发帖数: 105 | 2 60kd的多聚，100kd和25kd的相互结合？
流出体积／时间有参考标准么？
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 跑SEC遇到一个情况
: 样品里有3个蛋白，100 kDa，60 kDa，25 kDa
: 然后收集的洗脱峰跑胶发现
: 60 kDa先出来
: 再后来出来的是100 kDa和25 kDa一起
: 有什么可能会这样呢？
: 首先我肯定100 kDa不是25 kDa蛋白的oligomer形式
: 有wb及urea变性跑胶为证
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o****e
发帖数: 1011 | 3 蛋白的SEC retention time不仅跟蛋白的分子量大小有关系，跟蛋白分子的shape（
spherical, rod-like）也有关系。
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 跑SEC遇到一个情况
: 样品里有3个蛋白，100 kDa，60 kDa，25 kDa
: 然后收集的洗脱峰跑胶发现
: 60 kDa先出来
: 再后来出来的是100 kDa和25 kDa一起
: 有什么可能会这样呢？
: 首先我肯定100 kDa不是25 kDa蛋白的oligomer形式
: 有wb及urea变性跑胶为证
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 当时没跑标样
但是知道60 kDa的不是多聚，那个出来的时间/体积差不多是对的
【在 s*******n 的大作中提到】
: 60kd的多聚，100kd和25kd的相互结合？
: 流出体积／时间有参考标准么？
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 差不多明白你的意思
不过有这么离谱的么？
有没有人遇到过？
【在 o****e 的大作中提到】
: 蛋白的SEC retention time不仅跟蛋白的分子量大小有关系，跟蛋白分子的shape（
: spherical, rod-like）也有关系。
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m**z
发帖数: 787 | 6 which size exclusion column do you use ?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 差不多明白你的意思
: 不过有这么离谱的么？
: 有没有人遇到过？
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 superose 6, 24 ml total
【在 m**z 的大作中提到】
: which size exclusion column do you use ?
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o****e
发帖数: 1011 | 8 如果你这几种蛋白分子的形状以及"对SEC column填料的吸附性能"都差不多，
那出现你所观察到的那些现象是很奇怪。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 差不多明白你的意思
: 不过有这么离谱的么？
: 有没有人遇到过？
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 可不可以具体跟我说说？
只是做过一些SEC
但是对FPLC的东西不是特别熟
【在 o****e 的大作中提到】
: 如果你这几种蛋白分子的形状以及"对SEC column填料的吸附性能"都差不多，
: 那出现你所观察到的那些现象是很奇怪。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 10 这个很可能是因为100k 和 25k的蛋白有很强的结合力。在这种情况下他们就会
混在一起跑。
要核实的话可以做一个测试：
Native PAGE--> western blot
跑三条lane: 100kd along, 25kd along, 100+25 kd
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 跑SEC遇到一个情况
: 样品里有3个蛋白，100 kDa，60 kDa，25 kDa
: 然后收集的洗脱峰跑胶发现
: 60 kDa先出来
: 再后来出来的是100 kDa和25 kDa一起
: 有什么可能会这样呢？
: 首先我肯定100 kDa不是25 kDa蛋白的oligomer形式
: 有wb及urea变性跑胶为证
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m**z
发帖数: 787 | 11 good point!
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很可能是因为100k 和 25k的蛋白有很强的结合力。在这种情况下他们就会
: 混在一起跑。
: 要核实的话可以做一个测试：
: Native PAGE--> western blot
: 跑三条lane: 100kd along, 25kd along, 100+25 kd
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 跑native倒是没问题
不过我没有100 kDa along， 25 kDa along
本来跑SEC就是为了分离
结果还没能分开来
如果真的结合力很强的话那真是很强
4M Urea也没有能打破
不过我有个疑问
如果是结合力很强
那不是应该比60 kDa的早出来么？
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很可能是因为100k 和 25k的蛋白有很强的结合力。在这种情况下他们就会
: 混在一起跑。
: 要核实的话可以做一个测试：
: Native PAGE--> western blot
: 跑三条lane: 100kd along, 25kd along, 100+25 kd
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o****e
发帖数: 1011 | 13
SEC/FPLC基本原理一样啊："大"分子进入不了column填充粒子内部的细孔道，只能通过
各个填充粒子之间的空隙走，所以很快流出柱子，retention time短；"小"分子可以钻
进各个"填充粒子"内部的孔道，所以不容易从柱子里流出来，retention time长。
同样分子量的两种macromolecules A和B，如果A结构"非常紧凑"(compact)，而B结构"非
常舒展"(蓬松？)，那可能出现的情况就是A容易钻进填充粒子内部而B不能，于是造成A
的retention time相对长些。这时的情况就是，同样分子量的两种分子，各自的
retention time并不相同。（Light Scattering这方面比较有优势，可以测
hydrodynamic radius以及molar mass）
另一方面，A/B除了分子量，还可以有比如亲水/疏水等性质上的差别。"A/B分子本身对
column填充材料的吸附"也影响它们的retention time。A若格外容易"粘"在填充粒子上
的话，那A的retention time也因此要格外地长一些。一般eluent都是buffer，有salt或
其他additive，以减少"所分析的大分子"与填料粒子之间的non-specific binding。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可不可以具体跟我说说？
: 只是做过一些SEC
: 但是对FPLC的东西不是特别熟
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s********n
发帖数: 2939 | |
s******y
发帖数: 28562 | 15 那还真是，如果三种蛋白的形状差不多的话，的确应该是分子量大的先跑出来。
你这个情况的确很奇怪。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 跑native倒是没问题
: 不过我没有100 kDa along， 25 kDa along
: 本来跑SEC就是为了分离
: 结果还没能分开来
: 如果真的结合力很强的话那真是很强
: 4M Urea也没有能打破
: 不过我有个疑问
: 如果是结合力很强
: 那不是应该比60 kDa的早出来么？
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s********n
发帖数: 2939 | 16 最好有详细一点的信息，比如你所用的buffer和它们的洗脱体积(Ve). |
o****e
发帖数: 1011 | 17 （关于那个可能的100kD+25kD non-covalently linked proteins）
所接的100kD/25kD这个组分re-inject进SEC里重新看过吗？
仍然是single peak (retention time不变)吗？
4M urea也许不够，上6M guanidine hydrochloride（Gdn）或8M urea看看吧。
可以把protein混合物预先配在含比如6M Gdn的buffer里"待一会儿"，然后再把这个
mixture打入SEC column里（用含6M Gdn的buffer做eluent）。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 跑native倒是没问题
: 不过我没有100 kDa along， 25 kDa along
: 本来跑SEC就是为了分离
: 结果还没能分开来
: 如果真的结合力很强的话那真是很强
: 4M Urea也没有能打破
: 不过我有个疑问
: 如果是结合力很强
: 那不是应该比60 kDa的早出来么？
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s********n
发帖数: 2939 | 18 最好有详细一点的信息，比如你所用的buffer和它们的洗脱体积(Ve). |
C*******e
发帖数: 4348 | 19 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
250 mM NaCl
1 mM beata-ME
【在 s********n 的大作中提到】
: what kind of buffer?
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 谢谢
我记得哪里看过说SEC填料是略微带电的
但是不记得带的哪种电性
"非
成A
【在 o****e 的大作中提到】
: （关于那个可能的100kD+25kD non-covalently linked proteins）
: 所接的100kD/25kD这个组分re-inject进SEC里重新看过吗？
: 仍然是single peak (retention time不变)吗？
:
: 4M urea也许不够，上6M guanidine hydrochloride（Gdn）或8M urea看看吧。
: 可以把protein混合物预先配在含比如6M Gdn的buffer里"待一会儿"，然后再把这个
: mixture打入SEC column里（用含6M Gdn的buffer做eluent）。
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s********n
发帖数: 2939 | 21 看起来你的buffer没有问题，但是Superose 6的分离范围是5-5000 kDa，可能很难分清
100 kDa和60 kDa的区别。就像楼上说的，可能60 kDa的蛋白是多聚体，而100 kDa和25
kDa有比较强的相互作用吧。
跑个native gel看看吧。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 22 SEC不是在FPLC上做么？
FPLC是仪器，SEC是柱子的种类吧我觉得。我用FPLC也跑sephadex柱子的，那个应该算
SEC吧。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可不可以具体跟我说说？
: 只是做过一些SEC
: 但是对FPLC的东西不是特别熟
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m**z
发帖数: 787 | 23 with this resolution, some shape change of the protein will mess with the
separation. Even all proteins are sphere, 100kDa, 60kDa and 25kDa will not
be very far apart from this column I guess.
25
【在 s********n 的大作中提到】
: 看起来你的buffer没有问题，但是Superose 6的分离范围是5-5000 kDa，可能很难分清
: 100 kDa和60 kDa的区别。就像楼上说的，可能60 kDa的蛋白是多聚体，而100 kDa和25
: kDa有比较强的相互作用吧。
: 跑个native gel看看吧。
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 我的意思就是说虽然做过一些FPLC的东西
但是对整个liquid chromatography的东西都不是很熟
知道原理
跑过SEC，resource Q, resource S
不过都是几次而已，没多少经验
所以才需要求教嘛
【在 T**********t 的大作中提到】
: SEC不是在FPLC上做么？
: FPLC是仪器，SEC是柱子的种类吧我觉得。我用FPLC也跑sephadex柱子的，那个应该算
: SEC吧。
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 谢谢。
看来我要换种柱子才好
另外洗脱体积是这样的：
24 ml的柱子， 0.7 ml/min
60 kDa在18.9-22.9 min出来
100 kDa和25 kDa的在254.5-28.2 min出来
25
【在 s********n 的大作中提到】
: 看起来你的buffer没有问题，但是Superose 6的分离范围是5-5000 kDa，可能很难分清
: 100 kDa和60 kDa的区别。就像楼上说的，可能60 kDa的蛋白是多聚体，而100 kDa和25
: kDa有比较强的相互作用吧。
: 跑个native gel看看吧。
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s********n
发帖数: 2939 | 26 这两个峰区别还是很明显的，但是如果是多聚体的话就很难说了，你可以就你现有的两
个fractions跑一下native gel和SDS-PAGE作对照看看60 kDa的蛋白是否是多聚体，100
kDa和25 kDa是不是有相互作用。然后再选择合适分离范围的柱子。
祝你好运！ |
d****h
发帖数: 21 | 27 你的蛋白是细胞还是细菌表达的？如果是E.coli里的话，这个60kd很可能是hsp60 本身
就是多聚体，出峰的位置和void volume一致。我不知道superose 6的void是多少，如
果符合的话可以确认是60kd是多聚体。25kd也可能是你的100kd降解了一小部分？ |
s******y
发帖数: 28562 | 28 I agree. It appears that her 60kD protein may have been denatured into
aggragagte and that's why it ran out in the void volume
【在 d****h 的大作中提到】
: 你的蛋白是细胞还是细菌表达的？如果是E.coli里的话，这个60kd很可能是hsp60 本身
: 就是多聚体，出峰的位置和void volume一致。我不知道superose 6的void是多少，如
: 果符合的话可以确认是60kd是多聚体。25kd也可能是你的100kd降解了一小部分？
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